MAP足場などの粒状材料は、連結されたマイクロサイズのヒドロゲル粒子から作られた多孔質の注射可能な材料です。粒子分率の制御は、材料特性と細胞応答にとって重要です。MAPスキャフォールド内の可変粒子画分は、さまざまな足場特性と細胞応答をもたらしますが、この手法により、ユーザーは作成したMAPスキャフォールドの最終的な粒子画分を定義できます。
MAP足場は、複雑な創傷の修復および再生を促進するため、ならびに薬物を送達するために使用することができる。粒子画分は、例えば、細胞浸潤および再生の速度および程度に影響を及ぼす。この方法は、すべてのクラスの粒状ヒドロゲルに適用できます。
ユーザーが制御した粒子画分でMAPスキャフォールドを作成できるようになったので、これらの材料の生物活性を再現性よく研究し、閉じ込めなどのユニークな細胞応答を調べることができます。マイクロ流体ミクロゲルの生成を設定するには、技術を学ぶための時間と忍耐が必要です。セットアップで問題が発生した場合に備えて、複数のデバイスを準備して準備しておくことをお勧めします。
ヒアルロン酸(HA)とノルボルネン(NB)ミクロゲルのマイクロ流体生産から始めます。ミクロゲルを乾燥させる前に、クライオセーフスクリューキャップチューブの重量を量ります。次に、滅菌フード内で、洗浄および精製したミクロゲルを、容積式ピペットを使用して低温安全スクリューキャップチューブに移します。
精製したミクロゲルに70%エタノールを加え、よく混ぜます。チューブを5, 000 gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、70%エタノールを加える。
よく混ぜて摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、短時間遠心分離して、ミクロゲルがチューブの底にあることを確認します。極低温容器に液体窒素を加え、ミクロゲルのチューブを置いて瞬間凍結します。
5〜10分後、鉗子でミクロゲルのチューブを取り外します。キャップをすばやく取り外し、ラボグレードのティッシュでチューブを覆います。ティッシュを輪ゴムで固定し、凍結乾燥容器またはチャンバーに移します。
製造元の指示に従ってサンプルを凍結乾燥機にロードし、0.066 Torrおよびマイナス63°Cで凍結乾燥します。凍結乾燥されたミクロゲルを室温で保存する前に、チューブから重量を量ります。ポリジメチルシロキサン、又はPDMSエラストマー基剤と硬化剤を1質量比で10対1の割合で混合する。
PDMS混合物を大きなプラスチック製のペトリ皿に注ぎ、デシケーターで30分間、またはすべての気泡が消えるまで脱気します。すべての気泡が消えたら、3Dプリントされた金型をPDMSに慎重に配置して、新しい気泡の形成を最小限に抑えます。PDMSを硬化させるために、摂氏60度のオーブンに2時間入れます。
硬化後は、ナイフやカミソリの刃で培養装置の周囲をやさしくなぞり、慎重に型を取り出します。4ミリメートルの生検パンチを使用して、ウェルの底からPDMSを取り除きます。ガラスカバースリップに収まるようにデバイスをカットします。
テープを使用して、培養装置の底面からほこりを取り除きます。清潔なガラスカバースリップと培養装置を135°Cのホットプレートに15分間置き、水分を取り除きます。ヒュームフードで、ガラスカバースリップとデバイスの底面の高い位置にコロナプラズマガンを30秒間使用します。
次に、処理された表面をすばやく接着します。培養装置とガラスカバースリップの間の良好なシールを確保するために、静かに圧力をかけます。デバイスを摂氏60度のオーブンに一晩置き、ボンドを固定します。
翌日、装置をオートクレーブし、インビトロでの使用前に滅菌する。次に、MAPスキャフォールドにおける細胞培養用の所望の粒子画分に基づいて、微多孔性アニール粒子またはMAPスキャフォールド成分を調製する。凍結乾燥ミクロゲルを秤量して、ミクロゲルの質量を決定する。
次いで、選択された重量パーセントMAPに基づいて細胞培地の最終MAP体積の84%でミクロゲルを再構成する。ミクロゲルを20分間膨潤させる。ヒアルロン酸、またはHA-テトラジン、および細胞培地を最終MAP体積の16%に溶解します。
細胞が目的のコンフルエントに達したら、細胞を持ち上げてカウントします。マイクロリットルMAPあたり10, 000セルを新しいチューブに移します。細胞を遠心分離し、細胞を吸引せずにペレットから上清を吸引する。
置換ピペットを使用して、ミクロゲルと架橋剤をペレットに追加します。よく混ぜ、ウェルあたり10マイクロリットルを播種します。円運動でピペットして、混合物をウェル内に均等に分配する。
ミクロゲルを摂氏37度で25分間アニールしてから、細胞培地を加えてウェルを満たします。3D 培養を摂氏 37 度に維持し、必要に応じて培地を交換します。足場の吸引を避けるために、上部ウェルの尾根に沿ってピペットチップを安定させます。
目的の時点で、培地をウェルあたり50マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドと室温で30分間交換してサンプルを修正します。サンプルを50マイクロリットルのPBS、または好ましいバッファーで3回洗浄し、作業量としてウェルあたり50マイクロリットルを使用して免疫蛍光または蛍光染色に進みます。フローフォーカシング領域を有するマイクロ流体デバイスは、直径50または100ミクロンのHA-NBミクロゲルを生成することが示された。
ミクロゲルを凍結乾燥するための培地は、70%エタノールを使用することによってクリオゲル形成を最小限に抑えるように最適化されました。ただし、イソプロピルアルコール、水、アセトニトリルなどの他の媒体を同じ意味で使用できるため、クライオゲルの形成を促進することができます。HA-NBミクロゲルの生体直交インターリンクを促進するために、直鎖状HA-テトラジン架橋剤を合成した。
プロトンNMR分光法は、テトラジンペンダント基を有するHAリピートユニットの11%の修飾に成功したことを示しています。乾燥した凍結乾燥ミクロゲル生成物を特別な容量で再水和し、アニールして、MAP足場中のミクロゲルの異なる重量パーセント製剤を達成した。MAP足場におけるミクロゲルのこれらの重量百分率は、固有の粒子画分に対応していた。
MAPスキャフォールドでの細胞培養をここに示します。MAPスキャフォールドの3D培養中の細胞を5日目に固定し、染色し、共焦点顕微鏡で画像化しました。単一のZスライスは、異なる重量パーセントMAPを含む細胞増殖および足場の違いを示す。
凍結乾燥媒体は、クライオゲルが必要かどうかに応じて適切に選択してください。ミクロゲルが培地中で膨潤するのに十分な時間を確保するために、インキュベーションステップをスキップしないでください。顕微鏡、フローサイトメトリー、RNAシーケンシングなどの標準的な技術を使用して、定義された多孔性を有するこれらの顆粒状材料内の細胞応答を評価することができます。
