توفر البروتوكولات طريقة لفحص الأنشطة المضادة للميكروبات للجسيمات النانوية والأسطح ذات البنية النانوية من تحقيقات المرحلة الأولية إلى فحوصات السطح الأكثر تعقيدا. على عكس الطرق الموصوفة سابقا والتي أسفرت عن بيانات لا تضاهى عبر الدراسات ، تنتج هذه الطرق نتائج متسقة وقابلة للمقارنة عبر مواد الجسيمات النانوية المختلفة والمواد ذات البنية النانوية والأنواع الميكروبية. قد يكون الحفاظ على توزيع متجانس للجسيمات النانوية في الطريقتين A و B أمرا صعبا.
ستضمن عينات الدوامة بدقة تعليق الجسيمات النانوية ، كما أن سحب العينات ثلاث إلى أربع مرات بين الحصص سيحافظ على المعلقات ابدأ في جمع البكتيريا المستزرعة عن طريق اقتباس ملليلتر واحد من المزرعة البكتيرية المزروعة بين عشية وضحاها في أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 ملليلتر. بعد إنشاء عدد كاف من القسامات ، قم بطردها للوصول إلى كثافة الجلوس المطلوبة. اجمع المادة الطافية في وعاء التجميع.
وأعد تعليق حبيبات الخلية في 0.5 ملليلتر من وسط النمو الطازج. الجمع بين التعليق من أنبوبين ، وكرر الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي ، قم بغسل ثان بوسط نمو جديد وكرر دمج المحتوى من أنبوبين في أنبوب واحد قبل الطرد المركزي للأنابيب.
أعط الغسيل الثالث مع 0.33 ملليلتر من العازلة تريس أو هيدروكسي إيثيل أمينوميثان العازلة. اجمع بين المعلقات الثلاثة ، كل منها بحجم 0.33 ملليلتر ، في جهاز طرد مركزي صغير واحد سعة 1.5 ملليلتر. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية من الخلايا المحببة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت الطازج الذي سيعرف باسم تعليق الخلية أو ثقافة البذر البكتيري في مرحلة التأخر.
لتشكيل مزارع البكتيريا والجسيمات النانوية ، قم بقسمة ملليلتر من مزرعة البذر البكتيرية في كل بئر من 12 صفيحة بوليسترين غير معالجة بالأنسجة جيدا. لكل أنبوب طرد مركزي صغير سعة خمسة ملليلتر يحتوي على جزيئات أكسيد المغنيسيوم الموزونة مسبقا ، أضف ثلاثة ملليلتر من ثقافة البذر البكتيري. ودوامة الأنبوب لفترة وجيزة لخلط جسيمات أكسيد المغنيسيوم النانوية مع البكتيريا.
بعد الخلط ، يتم تعليق المليلتر الواحد من جسيمات أكسيد المغنيسيوم النانوية إلى ثلاثة آبار منفصلة لإنشاء عينات ثلاثية لكل وزن تم قياسه مسبقا لجسيمات أكسيد المغنيسيوم النانوية. احتضان العينة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة. وانقل عينة من ثلاثة ملليلترات إلى أنبوب مخروطي فردي حجمه 15 ملليلترا باستخدام ماصة.
ثم قم بإجراء تخفيف تسلسلي من واحد إلى 10 في لوحة بئر 96 عن طريق إضافة 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت tris إلى كل بئر في الصف B إلى الصف G للعدد المناسب من الأعمدة. دوامة لفترة وجيزة أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على عينات بكتيرية ، وإضافة 50 ميكرولتر من العينة البكتيرية إلى بئر فردي في الصف A.بعد ذلك ، من الصف A ، انقل 20 ميكرولترا من العينة البكتيرية إلى البئر المقابل للصف B مع خلط قصير. باستخدام طرف ماصة معقم ، انقل 20 ميكرولترا من البئر في الصف B إلى البئر المقابل في الصف C.استمر في ذلك حتى الصف G لإكمال التخفيف التسلسلي من 10 إلى سالب واحد في الصف B إلى 10 إلى سالب ستة في الصف G.بمجرد الانتهاء من ذلك ، ماصة 100 ميكرولتر من كل بئر في لوحة أجار نمو مناسبة ، وانتشرت عبر اللوحة لتفريق ثقافة الخلية.
ضع ألواح البئر في شاكر حاضنة طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، واحتضن ألواح الآجار عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. افحص اللوحة ، وعد الألواح التي تحتوي على ما يقرب من 25 إلى 300 مستعمرة. إذا أمكن ، اختر لوحات من نفس قيمة التخفيف.
لكل مادة يتم اختبارها ، قم بتخفيف العينات البكتيرية الليلية عن طريق إضافة ثلاثة قسامات سعة 200 ميكرولتر إلى وسط النمو إلى ثلاثة آبار ، وثلاثة حصص سعة 200 ميكرولتر من المستنبت البكتيري إلى آبار إضافية. ضع لوحة البئر 96 في قارئ اللوحة وامسحها ضوئيا. إذا لزم الأمر ، استمر في إضافة المرق أو الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر ، أو OD 600 ، إلى 0.01 تقريبا.
لتحضير معلقات الجسيمات النانوية البكتيرية ومعلقات الجسيمات النانوية للوسائط المعقمة ، قم بإزالة ملليلتر واحد من الثقافة البكتيرية أو الوسط من مجموعة ثلاثية من الأنابيب المخروطية 15 ملليلتر. وأضفه إلى أنبوب طرد مركزي سعة خمسة ملليلتر يحتوي على جسيمات نانوية تم قياسها مسبقا. دوامة الأنابيب لخلط الحل.
توزيع الجسيمات النانوية بشكل متجانس عن طريق نقل قسمة ملليلتر واحد من أنبوب الطرد المركزي سعة خمسة ملليلتر إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 ملليلتر. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتخصيص 200 ميكرولتر من كل عينة في الآبار الفردية للوحة بئر 96. بعد تحديد كثافة الجلوس الموصوفة سابقا ، أضف العينات والتحكم في الآبار الفردية للوحة البوليسترين غير المعالجة بالأنسجة المكونة من 48 بئرا.
بعد ذلك ، قم بقسمة 0.75 ملليلتر من معلق الخلية في كل بئر يحتوي على العينات والضوابط. ضع صفيحة البئر 48 في شاكر حاضنة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 120 دورة في الدقيقة. بعد الحضانة ، اجمع عينتين من كل مجموعة ، وانقلها بشكل فردي إلى أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة خمسة ملليلتر.
أضف ملليلتر من سائل الجسم المحاكي المنقح ، أو RSBF ، إلى كل أنبوب. تحضير أوراق السليلوز النيتروز المعقمة عن طريق قصها إلى سنتيمتر واحد من القطر. ضع ورق النيتروسليلوز المقطوع على طبق أجار يحتوي على الوسط المناسب.
بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من المزرعة البكتيرية المخففة على ورق الترشيح قبل إضافة 50 ميكرولترا من وسط مناسب إلى مركز كل سطح عينة. باستخدام ملاقط معقمة ، التقط ورق السيلوز النيتريك من سطح البريم. اقلب ورق السليلوز النيتريك بعناية وضعه على سطح العينة بحيث تتلامس البكتيريا مع 50 ميكرولترا من الوسط والسطح النانوي محل الاهتمام.
إذا كانت العينة قابلة للتحلل في الثقافة ، فضع حاملا تحتها لرفعها لتجنب ملامسة المخزن المؤقت tris. حافظ على الرطوبة عن طريق إضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت tris إلى عينة تحتوي على بئر. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، اجمع ورق النيتروسليلوز من كل سطح عينة وضعه في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت tris.
دوامة أوراق الترشيح التي تم جمعها وعينات المواد النانوية لمدة خمس ثوان. اجمع معلقات tris العازلة من العينة وضعها في أنابيب تجميع فردية جديدة. حددت التأثيرات المضادة للميكروبات باستخدام الطريقة A الحد الأدنى والتركيز المثبط ، أو MIC ، من ملليغرام واحد لكل ملليلتر من جسيمات أكسيد المغنيسيوم النانوية ، والحد الأدنى من تركيزات مبيد الجراثيم ، أو MBC 99.9 ، من 1.0 و 1.6 ملليغرام لكل ملليلتر من جسيمات أكسيد المغنيسيوم النانوية للإشريكية القولونية سلبية الجرام والزائفة الزنجارية على التوالي.
أظهرت المكورات العنقودية الجلدية إيجابية الجرام ، S.Aureus ، والمكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين ، أو MRSA ، قيم MIC البالغة 0.5 و 0.7 وملليغرام واحد لكل جسيمات أكسيد المغنيسيوم النانوية ملليلتر على التوالي. تم تحديد قيم NBC 99.99 البالغة 1.6 و 1.2 ملليغرام لكل ملليلتر ل S.epidermis و S.aureus على التوالي. بينما لم يتم تخفيض MRSA إلى ما بعد NBC 90.
تم تحديد MICs من 1.2 وواحد ملليغرام لكل ملليلتر في أنواع المبيضات الحساسة للأدوية والمقاومة للأدوية ، C albicans ، و C albicans مقاومة للفلوكونازول ، أو FR على التوالي. في المقابل ، أظهرت جسيمات أكسيد المغنيسيوم النانوية قيم MIC تبلغ واحدا و 0.7 ملليغرام لكل ملليلتر ، أو C.glabrata و C glabrata echinocandin مقاومة ، أو ER على التوالي. وصل كل نوع مرشح إلى NBC 90 من 0.7 إلى 1.2 ملليغرام لكل ملليلتر ، ولكن تم تخفيض C.glabrata ER فقط إلى NBC 99.9 عند 1.2 ملليغرام لكل ملليلتر.
في الطريقة B ، نمت MRSA المعرضة للجسيمات النانوية بشكل كبير إلى OD من 0.85. أدى التعرض ل 1.2 ملليغرام لكل ملليلتر من جسيمات أكسيد المغنيسيوم النانوية و 6.25 ملليغرام لكل ملليلتر من تريميثوبريم إلى 80.2٪ و 81.6٪ من انخفاض نمو البكتيريا على التوالي. وبالمثل ، فإن 2.9 ملليغرام لكل ملليلتر من جسيمات هيدروكسيد المغنيسيوم النانوية قلل من نمو البكتيريا إلى 70.3٪ أدى التعرض لميكرولتر واحد لكل ملليلتر من الفانكومايسين إلى انخفاض بنسبة 99.99٪ في نمو MRSA ، مما يشير إلى نشاط جراثيم أكسيد المغنيسيوم وجزيئات هيدروكسيد المغنيسيوم النانوية.
لم تظهر الطريقة C أي تثبيط لنمو البكتيريا مع الاتصال غير المباشر. أشارت النتائج إلى أن ZC21 كان له أقوى نشاط مضاد للبكتيريا ضد التصاق ونمو MRSA ، لجميع العينات التي تم اختبارها. في الطريقة D ، لم يتم تحديد المكورات العنقودية الذهبية القابلة للحياة في عينات 1.9A و 1.9 AA و EPD ، أو أوراق الترشيح المقترنة بها.
ومع ذلك ، فإن التعرض لعينات EPD بعد الركوع قلل من نمو البكتيريا إلى عدد قليل من الخلايا على السطح النانوي وورق الترشيح المقلص. أدى تحديد أنشطة مضادات الميكروبات للجسيمات النانوية والأسطح ذات البنية النانوية إلى إجراء تحقيقات إضافية في تطبيقات الهندسة الحيوية ، بما في ذلك تلك المتعلقة بالجروح المزمنة والالتهابات المرتبطة بالزرع.
