이 프로토콜은 예비 단계 조사에서 보다 복잡한 표면 검사에 이르기까지 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 검사하는 방법을 제공합니다. 연구 전반에 걸쳐 비교할 수 없는 데이터를 초래한 이전에 설명한 방법과 달리 이러한 방법은 다양한 나노 입자 재료, 나노 구조 재료 및 미생물 종에 걸쳐 일관되고 비교 가능한 결과를 생성합니다. 방법 A와 B에서 나노 입자의 균일 한 분포를 유지하는 것은 어려울 수 있습니다.
샘플을 철저히 소용돌이 치면 나노 입자 현탁액이 보장되고 부분 표본 사이에 3-4 회 피펫 팅이 현탁액을 유지합니다. 하룻밤 사이에 자란 박테리아 배양 물 1 밀리리터를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 분주하여 배양 된 박테리아 수집을 시작합니다. 충분한 수의 분취액을 만든 후 원하는 좌석 밀도에 도달하도록 원심 분리합니다. 상청액을 수집 용기에 수집합니다.
세포 펠릿을 0.5 밀리리터의 신선한 성장 배지에 재현탁시킨다. 두 튜브의 현탁액을 결합하고 원심 분리를 반복하십시오. 원심 분리 후, 신선한 성장 배지로 두 번째 세척을하고 튜브를 원심 분리하기 전에 두 개의 튜브에서 내용물을 하나로 결합하는 것을 반복하십시오.
0.33 밀리리터의 트리스 완충액 또는 히드 록시 에틸 아미노 메탄 완충액으로 세 번째 세척을하십시오. 각각 0.33 밀리리터 부피의 3 개의 현탁액을 하나의 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기로 결합합니다. 원심분리 후, 펠릿화된 세포로부터 상청액을 제거하고, 세포 현탁액 또는 래그 단계 박테리아 파종 배양으로 알려진 1밀리리터의 신선한 트리스 완충액에 세포 펠릿을 다시 현탁시킨다.
박테리아 및 나노입자 배양물을 형성하기 위해, 2밀리리터의 박테리아 파종 배양물을 조직 처리되지 않은 폴리스티렌 플레이트의 12웰의 각 웰에 분취한다. 미리 칭량된 산화마그네슘 입자가 들어 있는 각 5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 3밀리리터의 박테리아 파종 배양물을 추가합니다. 튜브를 잠깐 소용돌이치게 하여 산화마그네슘 나노입자와 박테리아를 혼합한다.
혼합 후, 산화마그네슘 나노입자 현탁액 1밀리리터를 3개의 개별 웰에 분취하여 산화마그네슘 나노입자의 미리 측정된 중량의 3배 샘플을 생성하였다. 샘플을 섭씨 37도 및 120rpm에서 밤새 배양합니다. 그리고 피펫을 사용하여 3 밀리리터 샘플을 개별 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 적절한 수의 컬럼에 대해 행 B에서 행 G의 각 웰에 180마이크로리터의 트리스 버퍼를 추가하여 96웰 플레이트에서 1-10회 연속 희석을 수행합니다. 박테리아 샘플이 들어 있는 15밀리리터 원뿔형 튜브를 간단히 와동시키고 50마이크로리터의 박테리아 샘플을 행 A.Next의 개별 웰에 추가합니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 B 행의 웰에서 C 행의 해당 웰로 20 마이크로 리터를 옮깁니다.G 행까지 계속하여 B 행의 10에서 10 행의 음극 6까지 연속 희석을 완료합니다. 플레이트를 가로질러 퍼뜨려 세포 배양물을 분산시킨다.
웰 플레이트를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 인큐베이터 셰이커에 넣고 한천 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 인큐베이션합니다. 플레이트를 검사하고, 대략 25 내지 300개의 콜로니를 갖는 플레이트를 계수한다. 가능하면 동일한 희석 값의 플레이트를 선택하십시오.
시험할 각 물질에 대해, 성장 배지에 3개의 200 마이크로리터 분취액을 3개의 웰에 첨가하고, 박테리아 배양의 3개의 200 마이크로리터 분취액을 추가 웰에 첨가하여 하룻밤 박테리아 샘플을 희석한다. 96웰 플레이트를 플레이트 리더에 넣고 스캔합니다. 필요한 경우 600나노미터 또는 OD 600에서 광학 밀도가 약 0.01에 도달할 때까지 배양액을 계속 추가하거나 밤새 박테리아 배양을 계속합니다.
박테리아 나노 입자 현탁액 및 멸균 매체 나노 입자 현탁액을 제조하기 위해, 15 밀리리터 원뿔형 튜브의 삼중 세트로부터 1 밀리리터의 박테리아 배양 또는 배지를 제거한다. 그리고 미리 측정 된 나노 입자가 들어있는 5 밀리리터 원심 분리기 튜브에 첨가하십시오. 튜브를 소용돌이 치며 용액을 혼합합니다.
5 밀리리터 원심분리 튜브로부터 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 1 밀리리터 분취량을 옮겨 나노입자를 균질하게 분배한다. 완료되면 각 샘플 200마이크로리터를 96웰 플레이트의 개별 웰에 분취합니다. 앞서 설명한 착석 밀도를 결정한 후, 샘플 및 대조군을 48 웰 비조직 처리된 폴리스티렌 플레이트의 개별 웰에 추가합니다.
다음에, 0.75 밀리리터의 세포 현탁액을 샘플 및 대조군을 함유하는 각각의 웰에 분취한다. 48웰 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 인큐베이터 쉐이커에 넣고 120RPM으로 진탕합니다. 배양 후 각 그룹에서 두 개의 샘플을 수집하고 라벨이 붙은 5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 개별적으로 옮깁니다.
각 튜브에 2 밀리리터의 수정 된 모의 체액 (RSBF)을 추가하십시오. 멸균 된 아질산 셀룰로오스 종이를 직경 1cm로 잘라서 준비하십시오. 절단된 니트로셀룰로오스 종이를 적절한 배지가 들어 있는 한천 플레이트에 놓습니다.
다음으로, 희석된 박테리아 배양액 50마이크로리터를 여과지에 첨가한 후 각 샘플 표면의 중앙에 적절한 배지 50마이크로리터를 첨가합니다. 멸균 된 핀셋을 사용하여 오거 표면에서 질산 셀로스 종이를 집어 올립니다. 질산 셀룰로오스 종이를 조심스럽게 뒤집어 샘플 표면에 놓아 박테리아가 50 마이크로 리터의 배지 및 관심있는 나노 구조 표면과 접촉하도록합니다.
샘플이 배양 중에 분해되는 경우 트리스 버퍼와의 접촉을 피하기 위해 홀더를 그 아래에 놓아 들어 올리십시오. 1밀리리터의 트리스 완충액을 웰이 포함된 샘플에 추가하여 습도를 유지합니다. 하룻밤 배양 후, 각 샘플 표면으로부터 니트로셀룰로스 페이퍼를 수집하고, 이들을 5밀리리터의 트리스 완충액에 넣는다.
수집된 여과지와 나노표면 물질 샘플을 5초 동안 소용돌이칩니다. 샘플에서 트리스 버퍼 현탁액을 수집하고 개별 신선한 수집 튜브에 넣습니다. 방법 A를 사용한 항균 효과는 그람 음성 대장균 및 녹농균에 대해 산화 마그네슘 나노 입자 밀리리터 당 1 밀리그램의 최소 및 억제 농도 (MIC)와 산화 마그네슘 나노 입자의 밀리리터 당 1.0 및 1.6 밀리그램의 최소 살균 농도 (MBC 99.9)를 각각 확인했다.
그람 양성 포도상 구균 표피, S.Aureus 및 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 (MRSA)은 MIC의 값이 각각 밀리리터 당 0.5, 0.7 및 1 밀리그램 / 밀리리터 산화 마그네슘 나노 입자를 입증했습니다. 밀리리터당 1.6밀리그램 및 1.2밀리그램의 NBC 99.99 값이 각각 S.epidermis 및 S.aureus에 대해 확인되었습니다. MRSA는 NBC 90 이상으로 감소하지 않았습니다.
밀리리터당 1.2 및 1밀리그램의 MIC는 약물 민감성 및 약물 내성 칸디다 종, C 알비칸스 및 C 알비칸스 플루코나졸 내성 또는 FR에서 각각 확인되었습니다. 대조적으로, 산화 마그네슘 나노 입자는 밀리리터 당 1 및 0.7 밀리그램, 또는 C.glabrata 및 C glabrata echinocandin 내성 또는 ER의 MIC 값을 각각 입증했다. 각 후보 종은 밀리리터당 0.7 내지 1.2 밀리그램의 NBC 90에 도달했지만, C.glabrata ER만이 밀리리터당 1.2 밀리그램의 NBC 99.9로 감소되었다.
방법 B에서, 나노 입자에 노출 된 MRSA는 0.85의 OD로 기하 급수적으로 증가했다. 산화 마그네슘 나노 입자 밀리리터 당 1.2 밀리그램과 트리 메토 프림 밀리리터 당 6.25 밀리그램에 노출되면 박테리아 성장이 각각 80.2 %와 81.6 % 감소했다. 유사하게, 수산화 마그네슘 나노 입자의 밀리리터 당 2.9 밀리그램은 박테리아 성장을 70.3 %로 감소 시켰습니다 반코마이신 밀리리터 당 1 마이크로 리터에 노출되면 MRSA의 성장이 99.99 % 감소하여 산화 마그네슘 및 수산화 마그네슘 나노 입자의 정균 활성을 시사합니다.
방법 C는 간접 접촉으로 박테리아 성장을 억제하지 않는 것으로 나타났습니다. 결과는 ZC21이 시험된 모든 표본을 위한 MRSA의 접착 그리고 성장에 대하여 가장 강한 항균 활동이, 있었다는 것을 나타내었다. 방법 D에서는 1.9A, 1.9 AA 및 EPD 샘플 또는 쌍을 이루는 여과지에서 생존 가능한 황색포도상구균이 확인되지 않았습니다.
그러나, 무릎을 꿇은 후 EPD 샘플에 노출되면 나노 구조 표면 및 파싱 된 여과지에서 몇 개의 세포로 박테리아 성장이 감소했습니다. 나노 입자 및 나노 구조 표면 항균 활성을 식별하면 만성 상처 및 임플란트 관련 감염과 관련된 응용 분야를 포함하여 생명 공학 응용 분야에서 추가 조사가 이루어졌습니다.
