Los protocolos proporcionan un método para examinar las actividades antimicrobianas de las nanopartículas y las superficies nanoestructuradas desde las investigaciones de la etapa preliminar hasta los exámenes de superficie más complejos. A diferencia de los métodos descritos anteriormente que dieron como resultado datos incomparables en todos los estudios, estos métodos producen resultados consistentes y comparables en diferentes materiales de nanopartículas, materiales nanoestructurados y especies microbianas. Mantener una distribución homogénea de nanopartículas en los métodos A y B puede ser difícil.
El vórtice de muestras a fondo asegurará la suspensión de nanopartículas, y el pipeteo de tres a cuatro veces entre alícuotas mantendrá las suspensiones Comience a recolectar bacterias cultivadas alícuotas un mililitro del cultivo bacteriano cultivado durante la noche en tubos de microcentrífuga de 1.5 mililitros. Después de crear un número suficiente de alícuotas, centrifugarlas para alcanzar la densidad de asientos deseada. Recoja el sobrenadante en un recipiente de recolección.
Y vuelva a suspender el pellet celular en 0,5 mililitros de medio de crecimiento fresco. Combine la suspensión de dos tubos y repita la centrifugación. Después de la centrifugazización, dar un segundo lavado con medio de crecimiento fresco y repetir la combinación del contenido de dos tubos en uno antes de centrifugar los tubos.
Dé el tercer lavado con 0,33 mililitros de tampón tris o tampón hidroxietil aminometano. Combine las tres suspensiones, cada una de 0,33 mililitros de volumen, en una microcentrífuga de 1,5 mililitros. Después de la centrifugazización, retire el sobrenadante de las células peletizadas y vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de tampón tris fresco que se conocerá como suspensión celular o cultivo de siembra bacteriana en fase de retraso.
Para formar los cultivos de bacterias y nanopartículas, alícuota los dos mililitros del cultivo de siembra bacteriana en cada pocillo de una placa de poliestireno no tratado con tejido de 12 pocillos. Por cada tubo de microcentrífuga de cinco mililitros que contenga partículas de óxido de magnesio previamente pesadas, agregue tres mililitros del cultivo de siembra bacteriana. Y vortex el tubo brevemente para mezclar las nanopartículas de óxido de magnesio con las bacterias.
Después de mezclar, alícuota un mililitro de la suspensión de nanopartículas de óxido de magnesio en tres pocillos separados para crear las muestras triplicadas de cada peso premedido de nanopartículas de óxido de magnesio. Incubar la muestra durante la noche a 37 grados centígrados y 120 rpm. Y transfiera una muestra de tres mililitros a un tubo cónico individual de 15 mililitros usando una pipeta.
Luego realice una dilución en serie de uno a 10 en una placa de 96 pocillos agregando 180 microlitros de tampón tris a cada pocillo en la fila B a la fila G para el número apropiado de columnas. Brevemente vortex un tubo cónico de 15 mililitros que contenga muestras bacterianas, y agregue 50 microlitros de muestra bacteriana a un pocillo individual en la fila A.A continuación, desde la fila A, transfiera 20 microlitros de muestra bacteriana al pozo correspondiente de la fila B con una breve mezcla. Con una punta de pipeta estéril, transfiera 20 microlitros del pocillo de la fila B al pocillo correspondiente de la fila C.Continúe hasta la fila G para completar la dilución en serie de 10 a la negativa de la fila B a la de 10 a la seis negativa de la fila G.Una vez hecho esto, pipetear 100 microlitros de cada pocillo en una placa de agar de crecimiento adecuada, y se extienden a través de la placa para dispersar el cultivo celular.
Coloque las placas del pozo en una coctelera de incubadora durante la noche a 37 grados centígrados, e incube las placas de agar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Examine la placa y cuente las placas que tienen aproximadamente de 25 a 300 colonias. Si es posible, elija placas del mismo valor de dilución.
Para cada material a analizar, diluir las muestras bacterianas durante la noche agregando tres alícuotas de 200 microlitros al medio de crecimiento en tres pocillos, y tres alícuotas de 200 microlitros del cultivo bacteriano en pocillos adicionales. Coloque la placa de 96 pocillos en el lector de placas y escanéela. Si es necesario, continúe agregando caldo o cultivo bacteriano durante la noche hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros, o OD 600, alcance aproximadamente 0.01.
Para preparar suspensiones de nanopartículas bacterianas y suspensiones de nanopartículas de medios estériles, retire un mililitro de cultivo bacteriano o medio de un conjunto triplicado de tubos cónicos de 15 mililitros. Y agréguelo a un tubo de centrífuga de cinco mililitros que contenga nanopartículas premedidas. Vortex los tubos para mezclar la solución.
Distribuir las nanopartículas homogéneamente transfiriendo alícuotas de un mililitro del tubo centrífugo de cinco mililitros al tubo cónico de 15 mililitros. Una vez hecho esto, alícuota 200 microlitros de cada muestra en los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Después de determinar la densidad de asientos descrita anteriormente, agregue las muestras y el control en los pocillos individuales de una placa de poliestireno no tratado con tejido de 48 pocillos.
A continuación, alícuota los 0,75 mililitros de la suspensión celular en cada pocillo que contiene las muestras y los controles. Coloque la placa de 48 pocillos en una incubadora agitadora durante 24 horas a 37 grados centígrados, agitando a 120 RPM. Después de la incubación, recoja dos muestras de cada grupo y transfiéralas individualmente a tubos de microcentrífuga de cinco mililitros marcados.
Agregue dos mililitros de fluido corporal simulado revisado, o RSBF, a cada tubo. Prepare papeles esterilizados de celulosa nitrosa recortándolos en un centímetro de diámetro. Coloque el papel de nitrocelulosa cortado en una placa de agar que contenga el medio apropiado.
A continuación, agregue 50 microlitros del cultivo bacteriano diluido en el papel de filtro antes de agregar 50 microlitros de un medio apropiado al centro de cada superficie de muestra. Usando pinzas esterilizadas, recoja el papel de celosa nítrica de la superficie de la barrena. Voltea con cuidado el papel de celulosa nítrica y colócalo sobre la superficie de la muestra para que las bacterias estén en contacto con los 50 microlitros de medio y la superficie nanoestructurada de interés.
Si la muestra es degradable en cultivo, coloque un soporte debajo de ella para levantarla y evitar el contacto con el tampón tris. Mantenga la humedad agregando un mililitro de tampón de tris a una muestra que contenga pozo. Después de la incubación durante la noche, recoja el papel de nitrocelulosa de cada superficie de muestra y colóquelos en cinco mililitros de tampón tris.
Vortex los papeles de filtro recolectados y las muestras de material de nanosuperficie durante cinco segundos. Recoja las suspensiones tampón tris de la muestra y colóquelas en tubos de recolección frescos individuales. Los efectos antimicrobianos utilizando el método A identificaron una concentración mínima e inhibitoria, o CMI, de un miligramo por mililitro de nanopartículas de óxido de magnesio, y concentraciones bactericidas mínimas, o MBC 99.9, de 1.0 y 1.6 miligramos por mililitro de nanopartículas de óxido de magnesio para Escherichia coli gramnegativa y pseudomonas aeruginosa respectivamente.
El estafilococo grampositivo de la epidermis, S.Aureus, y el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, o SARM, demostraron los valores de la CMI de 0,5, 0,7 y un miligramo por mililitro de nanopartículas de óxido de magnesio, respectivamente. Se identificaron valores NBC 99.99 de 1.6 y 1.2 miligramos por mililitro para S.epidermis y S.aureus respectivamente. Mientras que MRSA no se redujo más allá de NBC 90.
Se identificaron CMI de 1,2 y un miligramo por mililitro en especies de cándida sensibles a los medicamentos y resistentes a los medicamentos, C albicans y C albicans resistentes al fluconazol, o FR, respectivamente. En contraste, las nanopartículas de óxido de magnesio demostraron valores de CMI de uno y 0,7 miligramos por mililitro, o C.glabrata y C glabrata echinocandina resistentes, o ER respectivamente. Cada especie candidata alcanzó un NBC 90 de 0.7 a 1.2 miligramos por mililitro, pero solo C.glabrata ER se redujo a NBC 99.9 a 1.2 miligramos por mililitro.
En el método B, MRSA expuesto a nanopartículas creció exponencialmente a un OD de 0,85. La exposición a 1,2 miligramos por mililitro de nanopartículas de óxido de magnesio y 6,25 miligramos por mililitro de trimetoprima dio lugar a un 80,2% y un 81,6% de reducción del crecimiento bacteriano, respectivamente. Del mismo modo, 2,9 miligramos por mililitro de nanopartículas de hidróxido de magnesio redujeron el crecimiento bacteriano al 70,3%La exposición a un microlitro por mililitro de vancomicina resultó en una reducción del 99,99% en el crecimiento de MRSA, lo que sugiere la actividad bacteriostática del óxido de magnesio y las nanopartículas de hidróxido de magnesio.
El método C no mostró inhibición del crecimiento bacteriano con contacto indirecto. Los resultados indicaron que ZC21 tenía la actividad antibacteriana más fuerte contra la adhesión y el crecimiento de MRSA, para todas las muestras analizadas. En el Método D, no se identificó ningún estafilococo áureo viable en las muestras de 1.9A, 1.9 AA y EPD, o sus papeles de filtro emparejados.
Sin embargo, la exposición a las muestras de EPD después de arrodillarse redujo el crecimiento bacteriano a unas pocas células en la superficie nanoestructurada y el papel de filtro recortado. La identificación de las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas ha llevado a investigaciones adicionales en aplicaciones de bioingeniería, incluidas las relacionadas con heridas crónicas e infecciones relacionadas con implantes.
