Os protocolos fornecem um método para examinar as atividades antimicrobianas de superfícies nanoestruturadas e nanoparticuladas desde investigações preliminares até exames de superfície mais complexos. Ao contrário dos métodos descritos anteriormente, que resultaram em dados incomparáveis entre os estudos, esses métodos produzem resultados consistentes e comparáveis em diferentes materiais de nanopartículas, materiais nanoestruturados e espécies microbianas. Manter uma distribuição homogênea de nanopartículas nos métodos A e B pode ser difícil.
Amostras de vórtice cuidadosamente garantirão a suspensão de nanopartículas, e pipetar três a quatro vezes entre alíquotas manterá as suspensões Comece a coletar bactérias cultivadas aliquotando um mililitro da cultura bacteriana cultivada durante a noite em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Depois de criar um número suficiente de alíquotas, centrifuga-as para atingir a densidade de assentos desejada. Recolha o sobrenadante num recipiente de recolha.
E ressuspenda o pellet celular em 0,5 mililitros de meio de crescimento fresco. Combine a suspensão de dois tubos e repita a centrifugação. Após a centrifugação, faça uma segunda lavagem com meio de crescimento fresco e repita a combinação do conteúdo de dois tubos em um antes de centrifugar os tubos.
Dê a terceira lavagem com 0,33 mililitros de tampão tris ou tampão hidroxietil aminometano. Combine as três suspensões, cada uma com volume de 0,33 mililitro, em uma microcentrífuga de 1,5 mililitro. Após a centrifugação, remova o sobrenadante das células peletizadas e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão tris fresco, que será conhecido como suspensão celular ou cultura de semeadura bacteriana em fase lag.
Para formar as culturas de bactérias e nanopartículas, aliquote os dois mililitros da cultura de semeadura bacteriana em cada poço de uma placa de poliestireno não tratada com tecido de 12 poços. Para cada tubo de microcentrífuga de cinco mililitros contendo partículas de óxido de magnésio pré-pesadas, adicionar três mililitros da cultura de semeadura bacteriana. E vórtice o tubo brevemente para misturar as nanopartículas de óxido de magnésio com as bactérias.
Após a mistura, aliquote um mililitro da suspensão de nanopartículas de óxido de magnésio em três poços separados para criar as amostras triplicadas de cada peso pré-medido de nanopartículas de óxido de magnésio. Incubar a amostra durante a noite a 37 graus Celsius e 120 rpm. E transfira uma amostra de três mililitros para um tubo cônico individual de 15 mililitros usando uma pipeta.
Em seguida, execute uma a 10 diluições seriadas em uma placa de 96 poços, adicionando 180 microlitros de tampão tris a cada poço na linha B à linha G para o número apropriado de colunas. Vórtice brevemente um tubo cônico de 15 mililitros contendo amostras bacterianas e adicione 50 microlitros de amostra bacteriana a um poço individual na linha A.Em seguida, da linha A, transfira 20 microlitros de amostra bacteriana para o poço correspondente da linha B com breve mistura. Usando uma ponta de pipeta estéril, transfira 20 microlitros do poço na linha B para o poço correspondente na linha C.Continue até a linha G para completar a diluição em série de 10 para o negativo na linha B a 10 para os seis negativos na linha G.Uma vez feito, pipetar 100 microlitros de cada poço em uma placa de ágar de crescimento apropriada, e espalhados pela placa para dispersar a cultura celular.
Coloque as placas de poço em um agitador de incubadora durante a noite a 37 graus Celsius e incube as placas de ágar a 37 graus Celsius por 24 horas. Examine a placa e conte as placas com aproximadamente 25 a 300 colônias. Se possível, escolha placas com o mesmo valor de diluição.
Para cada material a ser testado, diluir as amostras bacterianas durante a noite adicionando três alíquotas de 200 microlitros ao meio de crescimento em três poços e três alíquotas de 200 microlitros da cultura bacteriana em poços adicionais. Coloque a placa de 96 poços no leitor de placas e digitalize-a. Se necessário, continue adicionando caldo ou cultura bacteriana durante a noite até que a densidade óptica em 600 nanômetros, ou OD 600, seja atingida aproximadamente 0,01.
Para preparar suspensões de nanopartículas bacterianas e suspensões de nanopartículas de meios estéreis, remova um mililitro de cultura ou meio bacteriano de um conjunto triplicado de tubos cônicos de 15 mililitros. E adicioná-lo em um tubo centrífugo de cinco mililitros contendo nanopartículas pré-medidas. Vórtice os tubos para misturar a solução.
Distribuir as nanopartículas homogeneamente, transferindo alíquotas de um mililitro do tubo centrífugo de cinco mililitros para o tubo cônico de 15 mililitros. Uma vez feito, alíquota 200 microlitros de cada amostra nos poços individuais de uma placa de 96 poços. Depois de determinar a densidade de assentos descrita anteriormente, adicione as amostras e controle nos poços individuais de uma placa de poliestireno não tratada com tecido de 48 poços.
Em seguida, aliquote os 0,75 mililitros da suspensão celular em cada poço contendo as amostras e controles. Coloque a placa de 48 poços em um agitador de incubadora por 24 horas a 37 graus Celsius, com agitação a 120 RPM. Após a incubação, coletar duas amostras de cada grupo e transferi-las individualmente para tubos de microcentrífuga marcados de cinco mililitros.
Adicione dois mililitros de fluido corporal simulado revisado, ou RSBF, a cada tubo. Prepare papéis de celulose nitrosa esterilizados aparando-os em um centímetro de diâmetro. Coloque o papel nitrocelulose cortado numa placa de ágar contendo o meio adequado.
Em seguida, adicione 50 microlitros da cultura bacteriana diluída no papel de filtro antes de adicionar 50 microlitros de um meio apropriado ao centro de cada superfície da amostra. Usando pinças esterilizadas, pegue o papel nítrico celoso da superfície do trado. Vire cuidadosamente o papel de celulose nítrica e coloque-o na superfície da amostra para que as bactérias entrem em contato com os 50 microlitros de meio e a superfície nanoestruturada de interesse.
Se a amostra for degradável em cultura, coloque um suporte por baixo dela para erguê-la para evitar o contato com o tampão tris. Mantenha a umidade adicionando um mililitro de tampão tris a uma amostra contendo poço. Após a incubação durante a noite, colete o papel nitrocelulose de cada superfície da amostra e coloque-os em cinco mililitros de tampão tris.
Vórtice os papéis de filtro coletados e amostras de material nanosuperficial por cinco segundos. Recolher as suspensões tampão tris da amostra e colocá-las em tubos de recolha frescos individuais. Os efeitos antimicrobianos usando o método A identificaram concentração mínima e inibitória, ou CIM, de um miligrama por mililitro de nanopartículas de óxido de magnésio, e concentrações bacteriocidas, ou CBM 99,9, de 1,0 e 1,6 miligramas por mililitro de nanopartículas de óxido de magnésio para Escherichia coli gram-negativa e pseudomonas aeruginosa, respectivamente.
O Staphylococcus epidermis gram-positivo, S.Aureus, e Staphylococcus aureus resistente à meticilina, ou MRSA, demonstraram os valores da CIM de 0,5, 0,7 e um miligrama por mililitro de nanopartículas de óxido de magnésio, respectivamente. NBC 99,99 valores de 1,6 e 1,2 miligramas por mililitro foram identificados para S.epidermis e S.aureus, respectivamente. Enquanto MRSA não foi reduzido além da NBC 90.
CIMs de 1,2 e um miligrama por mililitro foram identificadas em espécies de candida sensíveis e resistentes a drogas, C albicans e C albicans resistente ao fluconazol ou FR, respectivamente. Em contraste, nanopartículas de óxido de magnésio demonstraram valores de CIM de um e 0,7 miligramas por mililitro, ou C.glabrata e C glabrata equinocandin resistentes, ou ER, respectivamente. Cada espécie candidata atingiu um NBC 90 de 0,7 a 1,2 miligramas por mililitro, mas apenas C.glabrata ER foi reduzido para NBC 99,9 a 1,2 miligramas por mililitro.
No método B, MRSA exposto a nanopartículas cresceu exponencialmente para um DO de 0,85. A exposição a 1,2 miligramas por mililitro de nanopartículas de óxido de magnésio e 6,25 miligramas por mililitro de trimetoprima resultou em 80,2% e 81,6% de redução do crescimento bacteriano, respectivamente. Da mesma forma, 2,9 miligramas por mililitro de nanopartículas de hidróxido de magnésio reduziram o crescimento bacteriano para 70,3%A exposição a um microlitro por mililitro de vancomicina resultou em uma redução de 99,99% no crescimento de MRSA, sugerindo a atividade bacteriostática de nanopartículas de óxido de magnésio e hidróxido de magnésio.
O método C não mostrou inibição do crescimento bacteriano com contato indireto. Os resultados indicaram que ZC21 apresentou a maior atividade antibacteriana contra a adesão e crescimento de MRSA, para todas as amostras testadas. No método D, não foram identificados estafilococos viáveis nas amostras de 1,9A, 1,9 AA e EPD, ou em seus papéis de filtro pareados.
No entanto, a exposição às amostras de EPD após um ajoelhamento reduziu o crescimento bacteriano para algumas células na superfície nanoestruturada e no papel de filtro pared. A identificação de atividades antimicrobianas de superfície nanoestruturada e nanopartículas levou a investigações adicionais em aplicações de bioengenharia, incluindo aquelas relacionadas a feridas crônicas e infecções relacionadas a implantes.
