Die Protokolle bieten eine Methode zur Untersuchung der antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen von Voruntersuchungen bis hin zu komplexeren Oberflächenuntersuchungen. Im Gegensatz zu zuvor beschriebenen Methoden, die in verschiedenen Studien zu unvergleichlichen Daten führten, liefern diese Methoden konsistente und vergleichbare Ergebnisse über verschiedene Nanopartikelmaterialien, nanostrukturierte Materialien und mikrobielle Spezies hinweg. Die Aufrechterhaltung einer homogenen Verteilung der Nanopartikel in den Methoden A und B kann schwierig sein.
Durch gründliches Vortexen der Proben wird die Suspension von Nanopartikeln sichergestellt, und durch drei- bis viermaliges Pipettieren zwischen den Aliquoten bleiben die Suspensionen erhalten. Beginnen Sie mit dem Sammeln kultivierter Bakterien, indem Sie einen Milliliter der über Nacht gewachsenen Bakterienkultur in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren. Nachdem Sie eine ausreichende Anzahl von Aliquoten hergestellt haben, zentrifugieren Sie diese, um die gewünschte Sitzdichte zu erreichen. Sammeln Sie den Überstand in einem Auffangbehälter.
Und suspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 Milliliter frischem Nährmedium. Kombinieren Sie die Suspension aus zwei Rohren und wiederholen Sie die Zentrifugalisierung. Nach dem Zentrifugalisieren eine zweite Wäsche mit frischem Nährmedium durchführen und das Kombinieren des Inhalts von zwei Röhrchen zu einem wiederholen, bevor Sie die Röhrchen zentrifugieren.
Die dritte Wäsche mit 0,33 Milliliter Tris-Puffer oder Hydroxyethylaminomethan-Puffer geben. Kombinieren Sie die drei Suspensionen mit jeweils 0,33 Milliliter Volumen zu einer 1,5-Milliliter-Mikrozentrifuge. Entfernen Sie nach der Zentrifugalisierung den Überstand aus den pelletierten Zellen und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in einem Milliliter frischem Tris-Puffer, der als Zellsuspension oder Verzögerungsphasen-Bakteriensaatkultur bezeichnet wird.
Um die Bakterien- und Nanopartikelkulturen zu bilden, aliquotieren Sie die zwei Milliliter der bakteriellen Seeding-Kultur in jeder Vertiefung einer 12-Well-Polystyrolplatte, die nicht mit Gewebe behandelt ist. Für jedes Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das vorgewogene Magnesiumoxidpartikel enthält, fügen Sie drei Milliliter der bakteriellen Keimkultur hinzu. Und wirbeln Sie das Röhrchen kurz, um die Magnesiumoxid-Nanopartikel mit den Bakterien zu vermischen.
Aliquotieren Sie nach dem Mischen einen Milliliter der Magnesiumoxid-Nanopartikelsuspension in drei separate Vertiefungen, um die dreifachen Proben jedes vorgemessenen Gewichts von Magnesiumoxid-Nanopartikeln herzustellen. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius und 120 U/min. Und übertragen Sie eine drei Milliliter große Probe mit einer Pipette in ein einzelnes konisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Führen Sie dann eine bis 10-serielle Verdünnung in einer 96-Well-Platte durch, indem Sie 180 Mikroliter Tris-Puffer zu jeder Vertiefung in Reihe B bis Reihe G für die entsprechende Anzahl von Säulen hinzufügen. Ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit Bakterienproben wird kurz vortexiert und 50 Mikroliter Bakterienprobe in eine einzelne Vertiefung in Reihe A gegeben.Als nächstes werden 20 Mikroliter Bakterienprobe aus Reihe A unter kurzem Mischen in die entsprechende Vertiefung von Reihe B überführt. Übertragen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze 20 Mikroliter aus der Vertiefung in Reihe B in die entsprechende Vertiefung in Reihe C.Fahren Sie damit bis zur Reihe G fort, um die Verdünnungsreihe von 10 auf die negative Verdünnung in Reihe B bis 10 auf die negativen sechs in Reihe G abzuschließen.Wenn Sie fertig sind, pipettieren Sie 100 Mikroliter jeder Vertiefung in eine geeignete Wachstumsagarplatte. und auf der Platte verteilen, um die Zellkultur zu verteilen.
Legen Sie die Well-Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator-Shaker und inkubieren Sie die Agarplatten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Untersuchen Sie die Platte und zählen Sie die Platten mit etwa 25 bis 300 Kolonien. Wählen Sie nach Möglichkeit Platten mit dem gleichen Verdünnungswert.
Für jedes zu testende Material verdünnen Sie die Bakterienproben über Nacht, indem Sie dem Nährmedium drei 200-Mikroliter-Aliquots in drei Vertiefungen und drei 200-Mikroliter-Aliquots der Bakterienkultur in weitere Vertiefungen geben. Legen Sie die 96-Well-Platte in den Plattenleser und scannen Sie sie. Falls erforderlich, fügen Sie die Brühe oder die Bakterienkultur über Nacht hinzu, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 etwa 0,01 erreicht ist.
Zur Herstellung von bakteriellen Nanopartikelsuspensionen und Nanopartikelsuspensionen für sterile Medien wird ein Milliliter Bakterienkultur oder -medium aus einem dreifachen Satz von konischen 15-Milliliter-Röhrchen entnommen. Und geben Sie es in ein Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit vorgemessenen Nanopartikeln. Wirbeln Sie die Röhrchen, um die Lösung zu mischen.
Verteilen Sie die Nanopartikel homogen, indem Sie ein Milliliter-Aliquote aus dem Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen in das konische 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Sobald dies erledigt ist, aliquotieren Sie 200 Mikroliter jeder Probe in die einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Nachdem die zuvor beschriebene Sitzdichte bestimmt wurde, werden die Proben und die Kontrolle in die einzelnen Vertiefungen einer 48-Well-Polystyrolplatte gegeben, die nicht mit Gewebe behandelt wurde.
Als nächstes werden die 0,75 Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung aliquotiert, die die Proben und Kontrollen enthält. Legen Sie die 48-Well-Platte für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einen Inkubatorschüttler und schütteln Sie sie mit 120 U/min. Nach der Inkubation werden zwei Proben aus jeder Gruppe entnommen und einzeln in beschriftete Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Geben Sie zwei Milliliter revidierte simulierte Körperflüssigkeit (RSBF) in jedes Röhrchen. Bereiten Sie sterilisiertes salpetriges Zellulosepapier vor, indem Sie es auf einen Durchmesser von einem Zentimeter zuschneiden. Legen Sie das geschnittene Nitrozellulosepapier auf eine Agarplatte, die das entsprechende Medium enthält.
Geben Sie anschließend 50 Mikroliter der verdünnten Bakterienkultur auf das Filterpapier, bevor Sie 50 Mikroliter eines geeigneten Mediums in die Mitte jeder Probenoberfläche geben. Nehmen Sie das Salpetercellosepapier mit einer sterilisierten Pinzette von der Oberfläche der Schnecke auf. Drehen Sie das Salpeterzellulosepapier vorsichtig um und legen Sie es auf die Probenoberfläche, so dass die Bakterien mit den 50 Mikrolitern des Mediums und der gewünschten nanostrukturierten Oberfläche in Kontakt kommen.
Wenn die Probe in Kultur abbaubar ist, legen Sie einen Halter darunter, um sie anzuheben, um den Kontakt mit dem Tris-Puffer zu vermeiden. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit aufrecht, indem Sie einen Milliliter Tris-Puffer in eine Probenvertiefung geben. Sammeln Sie nach der Inkubation über Nacht das Nitrozellulosepapier von jeder Probenoberfläche und geben Sie es in fünf Milliliter Tris-Puffer.
Verschieben Sie die gesammelten Filterpapiere und Nanooberflächenmaterialproben fünf Sekunden lang. Sammeln Sie die Tris-Puffersuspensionen aus der Probe und geben Sie sie in einzelne frische Sammelröhrchen. Die antimikrobiellen Wirkungen unter Verwendung der Methode A identifizierten eine minimale und hemmende Konzentration (MHK) von einem Milligramm pro Milliliter Magnesiumoxid-Nanopartikel und minimale bakteriozide Konzentrationen (MBC 99,9) von 1,0 bzw. 1,6 Milligramm pro Milliliter Magnesiumoxid-Nanopartikel für gramnegative Escherichia coli bzw. Pseudomonas aeruginosa.
Der grampositive Staphylococcus epidermis, S. Aureus, und der Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) wiesen die MHK-Werte von 0,5, 0,7 bzw. einem Milligramm pro Milliliter Magnesiumoxid-Nanopartikel auf. NBC 99,99 Werte von 1,6 bzw. 1,2 Milligramm pro Milliliter wurden für S. epidermis bzw. S. aureus identifiziert. Während MRSA nicht über NBC 90 hinaus reduziert wurde.
MICs von 1,2 und einem Milligramm pro Milliliter wurden bei arzneimittelempfindlichen und arzneimittelresistenten Candida-Spezies, C-albicanen bzw. C-albicans-Fluconazol-resistenten bzw. FR-resistenten Candida-Spezies identifiziert. Im Gegensatz dazu wiesen Magnesiumoxid-Nanopartikel MHK-Werte von einem und 0,7 Milligramm pro Milliliter auf, was C. glabrata bzw. C glabrata echinocandin resistant (ER) entspricht. Jede Kandidatenspezies erreichte einen NBC 90 von 0,7 bis 1,2 Milligramm pro Milliliter, aber nur C. glabrata ER wurde auf NBC 99,9 mit 1,2 Milligramm pro Milliliter reduziert.
In Methode B wuchs MRSA, die Nanopartikeln ausgesetzt waren, exponentiell auf einen OD von 0,85. Die Exposition gegenüber 1,2 Milligramm pro Milliliter Magnesiumoxid-Nanopartikeln und 6,25 Milligramm pro Milliliter Trimethoprim führte zu einem reduzierten Bakterienwachstum von 80,2 % bzw. 81,6 %. In ähnlicher Weise reduzierten 2,9 Milligramm pro Milliliter Magnesiumhydroxid-Nanopartikel das Bakterienwachstum auf 70,3 %Die Exposition gegenüber einem Mikroliter pro Milliliter Vancomycin führte zu einer Verringerung des MRSA-Wachstums um 99,99 %, was auf die bakteriostatische Aktivität von Magnesiumoxid und Magnesiumhydroxid-Nanopartikeln hindeutet.
Methode C zeigte keine Hemmung des Bakterienwachstums bei indirektem Kontakt. Die Ergebnisse zeigten, dass ZC21 bei allen untersuchten Proben die stärkste antibakterielle Aktivität gegen die Adhäsion und das Wachstum von MRSA aufwies. In Methode D wurde in den 1.9A-, 1.9 AA- und EPD-Proben oder ihren gepaarten Filterpapieren kein lebensfähiger Staphylokokken-Aureus identifiziert.
Die Exposition gegenüber den EPD-Proben nach einem Knien reduzierte jedoch das Bakterienwachstum auf wenige Zellen auf der nanostrukturierten Oberfläche und dem geschliffenen Filterpapier. Die Identifizierung antimikrobieller Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen hat zu weiteren Untersuchungen in biotechnischen Anwendungen geführt, einschließlich solcher im Zusammenhang mit chronischen Wunden und implantatbedingten Infektionen.
