Protokoller, nanopartikül ve nanoyapılı yüzeylerin antimikrobiyal aktivitelerini ön aşama araştırmalarından daha karmaşık yüzey incelemelerine kadar incelemek için bir yöntem sağlar. Çalışmalar arasında karşılaştırılamaz verilerle sonuçlanan daha önce tarif edilen yöntemlerin aksine, bu yöntemler farklı nanopartikül malzemeleri, nanoyapılı malzemeler ve mikrobiyal türler arasında tutarlı ve karşılaştırılabilir sonuçlar üretir. A ve B yöntemlerinde nanopartiküllerin homojen dağılımını sağlamak zor olabilir.
Vorteks numuneleri iyice nanopartikül süspansiyonu sağlayacak ve alikotlar arasında üç ila dört kez pipetleme süspansiyonları koruyacaktır Bir gecede yetiştirilen bakteri kültürünün bir mililitresini 1.5 mililitre mikro santrifüj tüplerine ayırarak kültürlenmiş bakterileri toplamaya başlayın. Yeterli sayıda alikot oluşturduktan sonra, istenen oturma yoğunluğuna ulaşmak için santrifüj yapın. Supernatant'ı bir toplama kabına toplayın.
Ve hücre peletini 0.5 mililitre taze büyüme ortamında tekrar askıya alın. Süspansiyonu iki tüpten birleştirin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Santrifüjlemeden sonra, taze büyüme ortamı ile ikinci bir yıkama yapın ve tüpleri santrifüj etmeden önce içeriğin iki tüpten birine birleştirilmesini tekrarlayın.
Üçüncü yıkamayı 0.33 mililitre tris tamponu veya hidroksietil aminometan tamponu ile yapın. Her biri 0,33 mililitre hacimli üç süspansiyonu bir adet 1,5 mililitrelik mikro santrifüjde birleştirin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı peletlenmiş hücrelerden çıkarın ve hücre peletini, hücre süspansiyonu veya gecikme fazı bakteriyel tohumlama kültürü olarak bilinen bir mililitre taze tris tamponunda yeniden askıya alın.
Bakterileri ve nanopartikül kültürlerini oluşturmak için, 12 iyi doku ile işlenmiş polistiren plakanın her bir kuyucuğundaki bakteri tohumlama kültürünün iki mililitresini aliquot. Önceden tartılmış magnezyum oksit parçacıkları içeren her beş mililitrelik mikro santrifüj tüpü için, üç mililitre bakteri tohumlama kültürü ekleyin. Ve magnezyum oksit nanopartiküllerini bakterilerle karıştırmak için tüpü kısaca vorteks.
Karıştırdıktan sonra, magnezyum oksit nanopartiküllerinin bir mililitresini aliquot, önceden ölçülen magnezyum oksit nanopartiküllerinin her bir ağırlığının üçlü örneklerini oluşturmak için üç ayrı kuyucuğa süspansiyon haline getirir. Numuneyi gece boyunca 37 santigrat derece ve 120 rpm'de inkübe edin. Ve üç mililitrelik bir numuneyi pipet kullanarak ayrı bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.
Ardından, uygun sayıda sütun için B satırındaki her bir kuyucuğa G satırına 180 mikrolitre tris tamponu ekleyerek 96 kuyucuklu bir plakada bir ila 10 seri seyreltme gerçekleştirin. Bakteriyel numuneler içeren 15 mililitrelik bir konik tüpü kısaca vorteksleyin ve A sırasındaki bireysel bir kuyucuğa 50 mikrolitre bakteri numunesi ekleyin.Daha sonra, A satırından, 20 mikrolitre bakteri numunesini kısa karıştırma ile B sırasının karşılık gelen kuyucuğuna aktarın. Steril bir pipet ucu kullanarak, B sırasındaki kuyudan C sırasındaki karşılık gelen kuyucuğa 20 mikrolitre aktarın.B sırasındaki 10'dan negatif olana seri seyreltmeyi tamamlamak için G satırına kadar buna devam edin 10'dan G sırasındaki negatif altıya kadar.Bir kez yapıldıktan sonra, pipet her bir kuyucuğun 100 mikrolitresini uygun bir büyüme agar plakasına yerleştirin, ve hücre kültürünü dağıtmak için plaka boyunca yayılır.
Kuyu plakalarını gece boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatör çalkalayıcıya yerleştirin ve agar plakalarını 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Plakayı inceleyin ve yaklaşık 25 ila 300 koloniye sahip plakaları sayın. Mümkünse, aynı seyreltme değerine sahip plakaları seçin.
Test edilecek her malzeme için, büyüme ortamına üç adet 200 mikrolitre alikot ekleyerek gece bakteri numunelerini üç kuyucuğa ve bakteri kültürünün üç adet 200 mikrolitrelik alikotunu ek kuyucuklara ekleyerek seyreltin. 96 kuyucuk plakasını plaka okuyucuya yerleştirin ve tarayın. Gerekirse, 600 nanometredeki optik yoğunluğa veya OD 600'e yaklaşık 0.01'e ulaşana kadar et suyu veya gece boyunca bakteri kültürü eklemeye devam edin.
Bakteriyel nanopartikül süspansiyonları ve steril ortam nanopartikül süspansiyonları hazırlamak için, 15 mililitrelik konik tüplerden oluşan üçlü bir setten bir mililitre bakteri kültürü veya ortamını çıkarın. Ve önceden ölçülmüş nanopartiküller içeren beş mililitrelik bir santrifüj tüpüne ekleyin. Çözeltiyi karıştırmak için tüpleri vorteks.
Beş mililitrelik santrifüj tüpünden 15 mililitrelik konik tüpe bir mililitre alikot aktararak nanopartikülleri homojen olarak dağıtın. Tamamlandığında, her numunenin 200 mikrolitresini 96 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aliquot edin. Daha önce tarif edilen oturma yoğunluğunu belirledikten sonra, numuneleri ekleyin ve 48 iyi doku ile muamele edilmemiş bir polistiren plakanın bireysel kuyucuklarına kontrol edin.
Daha sonra, hücre süspansiyonunun 0.75 mililitresini, numuneleri ve kontrolleri içeren her bir kuyucuğa aliquot. 48 kuyucuk plakasını 37 santigrat derecede 24 saat boyunca bir inkübatör çalkalayıcıya yerleştirin ve 120 RPM'de çalkalayın. İnkübasyondan sonra, her gruptan iki numune toplayın ve bunları ayrı ayrı etiketli beş mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın.
Her tüpe iki mililitre revize edilmiş simüle edilmiş vücut sıvısı veya RSBF ekleyin. Sterilize azotlu selüloz kağıtları bir santimetre çapında keserek hazırlayın. Kesilen nitroselüloz kağıdını uygun ortamı içeren bir agar plakasına yerleştirin.
Daha sonra, her bir numune yüzeyinin ortasına 50 mikrolitre uygun bir ortam eklemeden önce filtre kağıdına seyreltilmiş bakteri kültürünün 50 mikrolitresini ekleyin. Sterilize cımbız kullanarak, nitrik seloz kağıdını burgu yüzeyinden alın. Nitrik selüloz kağıdını dikkatlice çevirin ve numune yüzeyine yerleştirin, böylece bakteriler 50 mikrolitre ortam ve ilgilenilen nanoyapılı yüzey ile temas halinde olur.
Numune kültürde parçalanabiliyorsa, tris tamponu ile teması önlemek için kaldırmak için altına bir tutucu koyun. İyi içeren bir numuneye bir mililitre tris tamponu ekleyerek nemi koruyun. Gece boyunca inkübasyondan sonra, nitroselüloz kağıdını her numune yüzeyinden toplayın ve beş mililitre tris tamponuna yerleştirin.
Toplanan filtre kağıtlarını ve nanoyüzey malzeme örneklerini beş saniye boyunca vorteks. Tris tampon süspansiyonlarını numuneden toplayın ve bunları ayrı ayrı taze toplama tüplerine yerleştirin. Yöntem A kullanılarak yapılan antimikrobiyal etkiler, magnezyum oksit nanopartiküllerinin mililitresi başına bir miligramın minimum ve inhibitör konsantrasyonunu veya MIC'sini ve gram-negatif Escherichia coli ve pseudomonas aeruginosa için sırasıyla mililitre başına 1.0 ve 1.6 miligram magnezyum oksit nanopartiküllerinin minimum bakteriyosidal konsantrasyonlarını veya MBC 99.9'u tanımladı.
Gram-pozitif staphylococcus epidermis, S.Aureus ve metisiline dirençli staphylococcus aureus veya MRSA, MIC'nin sırasıyla mililitre magnezyum oksit nanopartikülleri başına 0.5, 0.7 ve bir miligram değerlerini gösterdi. S.epidermis ve S.aureus için sırasıyla mililitre başına 1.6 ve 1.2 miligramlık NBC 99.99 değerleri tespit edildi. MRSA, NBC 90'ın ötesine geçmedi.
Mililitre başına 1.2 ve bir miligramlık MIC'ler, sırasıyla ilaca duyarlı ve ilaca dirençli kandida türleri, C albicans ve C albicans flukonazole dirençli veya FR'de tanımlanmıştır. Buna karşılık, magnezyum oksit nanopartikülleri, mililitre başına bir ve 0.7 miligramlık MIC değerlerini veya sırasıyla C.glabrata ve C glabrata ekinosandin'e dirençli veya ER'yi göstermiştir. Her aday tür, mililitre başına 0.7 ila 1.2 miligramlık bir NBC 90'a ulaştı, ancak yalnızca C.glabrata ER, mililitre başına 1.2 miligramda NBC 99.9'a düşürüldü.
B yönteminde, nanopartiküllere maruz kalan MRSA, katlanarak 0.85'lik bir OD'ye büyüdü. Mililitre magnezyum oksit nanopartikülleri başına 1.2 miligram ve mililitre trimetoprim başına 6.25 miligrama maruz kalmak, sırasıyla% 80.2 ve% 81.6 oranında azalmış bakteri büyümesine neden olmuştur. Benzer şekilde, mililitre magnezyum hidroksit nanopartikülleri başına 2.9 miligram, bakteriyel büyümeyi% 70.3'e düşürdü Mililitre vankomisin başına bir mikrolitreye maruz kalmak, MRSA'nın büyümesinde% 99.99'luk bir azalma ile sonuçlandı, bu da magnezyum oksit ve magnezyum hidroksit nanopartiküllerinin bakteriyostatik aktivitesini düşündürdü.
Yöntem C, dolaylı temas ile bakteriyel büyümenin inhibisyonunu göstermedi. Sonuçlar, ZC21'in, test edilen tüm numuneler için MRSA'nın yapışmasına ve büyümesine karşı en güçlü antibakteriyel aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Yöntem D'de, 1.9A, 1.9 AA ve EPD örneklerinde veya bunların eşleştirilmiş filtre kağıtlarında uygulanabilir bir staph aureus tanımlanmamıştır.
Bununla birlikte, diz çöktükten sonra EPD örneklerine maruz kalmak, bakteri büyümesini nanoyapılı yüzeyde ve pared filtre kağıdında birkaç hücreye indirgemiştir. Nanopartikül ve nanoyapılı yüzey antimikrobiyal aktivitelerinin tanımlanması, kronik yaralar ve implantla ilişkili enfeksiyonlarla ilgili olanlar da dahil olmak üzere biyomühendislik uygulamalarında ek araştırmalara yol açmıştır.
