Протоколы обеспечивают метод изучения антимикробной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей от предварительных исследований до более сложных поверхностных исследований. В отличие от ранее описанных методов, которые привели к несопоставимым данным в разных исследованиях, эти методы дают последовательные и сопоставимые результаты для различных материалов наночастиц, наноструктурированных материалов и микробных видов. Поддержание однородного распределения наночастиц в методах А и В может быть затруднено.
Тщательное вихревое пробоотборие обеспечит суспензию наночастиц, а пипетирование три-четыре раза между аликвотами сохранит суспензии. Начните сбор культивируемых бактерий с аликвотирования одного миллилитра выращенной за ночь бактериальной культуры в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки. Создав достаточное количество аликвот, центрифугируйте их, чтобы достичь желаемой плотности посадки. Соберите надосадочную жидкость в емкость для сбора.
И повторно суспендировать гранулу клетки в 0,5 миллилитра свежей питательной среды. Соедините суспензию из двух пробирок и повторите центрифугализацию. После центрифугализации дайте вторую промывку свежей питательной средой и повторите объединение содержимого из двух пробирок в одну перед центрифугированием пробирок.
Дайте третью стирку 0,33 миллилитра трис-буфера или гидроксиэтиламинометанового буфера. Объедините три суспензии, каждая объемом 0,33 миллилитра, в одну микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра. После центрифугализации удалите надосадочную жидкость из гранулированных ячеек и повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре свежего трис-буфера, который будет известен как клеточная суспензия или бактериальная посевная культура лаг-фазы.
Чтобы сформировать культуры бактерий и наночастиц, аликвотируйте два миллилитра бактериальной посевной культуры в каждую лунку 12-луночной нетканевой полистирольной пластины. На каждую пятимиллилитровую микроцентрифужную пробирку, содержащую предварительно взвешенные частицы оксида магния, добавляют три миллилитра бактериальной посевной культуры. И ненадолго покрутите трубку, чтобы смешать наночастицы оксида магния с бактериями.
После смешивания аликвотируйте один миллилитр суспензии наночастиц оксида магния в три отдельные лунки, чтобы создать тройные образцы каждой предварительно измеренной массы наночастиц оксида магния. Инкубируйте образец в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 120 об/мин. И перенесите трехмиллилитровый образец в индивидуальную коническую трубку объемом 15 миллилитров с помощью пипетки.
Затем выполните последовательное разведение от одного до 10 в 96-луночном планшете, добавив 180 микролитров трис-буфера в каждую лунку в ряду B в строке G для соответствующего количества столбцов. Кратковременно встряхните 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую бактериальные образцы, и добавьте 50 микролитров бактериальной пробы в отдельную лунку в ряду А. Затем из ряда А перенесите 20 микролитров бактериальной пробы в соответствующую лунку ряда В с кратким перемешиванием. Используя стерильный наконечник пипетки, перенесите 20 микролитров из лунки в ряду B в соответствующую лунку в ряду C. Продолжайте это до ряда G, чтобы завершить последовательное разведение с 10 до отрицательного в ряду B до 10 до отрицательного шести в ряду G. После этого поместите пипетку по 100 микролитров каждой лунки в соответствующую пластину для выращивания агара, и распределить по тарелке, чтобы диспергировать культуру клеток.
Поместите луночные пластины в шейкер инкубатора на ночь при температуре 37 градусов по Цельсию и инкубируйте агаровые пластины при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. Осмотрите тарелку и подсчитайте пластины, содержащие примерно от 25 до 300 колоний. Если возможно, выбирайте пластины с одинаковым значением разбавления.
Для каждого тестируемого материала разбавьте ночные бактериальные образцы, добавив три 200 микролитровых аликвот в питательную среду в три лунки и три 200 микролитровых аликвот бактериальной культуры в дополнительные лунки. Поместите пластину с 96 лунками в считыватель пластин и отсканируйте ее. При необходимости продолжайте добавлять бульон или ночную бактериальную культуру до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нанометрах, или OD 600, не достигнет примерно 0,01.
Чтобы приготовить суспензии бактериальных наночастиц и суспензии наночастиц стерильных сред, удалите один миллилитр бактериальной культуры или среды из тройного набора конических трубок объемом 15 миллилитров. И добавьте его в пятимиллилитровую центрифужную пробирку, содержащую предварительно измеренные наночастицы. Перемешайте трубки, чтобы перемешать раствор.
Равномерно распределите наночастицы, перенеся один миллилитр аликвот из пятимиллилитровой центрифужной пробирки в 15-миллилитровую коническую пробирку. После этого аликвотируйте 200 микролитров каждого образца в отдельные лунки 96-луночной пластины. После определения плотности посадки, описанной ранее, добавьте образцы и проконтролируйте в отдельные лунки 48-луночную нетканевую полистирольную пластину.
Затем аликвотируйте 0,75 миллилитра клеточной суспензии в каждую лунку, содержащую образцы и контрольные элементы. Поместите тарелку с 48 лунками в шейкер инкубатора на 24 часа при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая при 120 об/мин. После инкубации соберите по два образца от каждой группы и переложите их по отдельности в маркированные пятимиллилитровые микроцентрифужные пробирки.
Добавьте два миллилитра пересмотренной смоделированной жидкости организма, или RSBF, в каждую пробирку. Подготовьте стерилизованную бумагу из азотистой целлюлозы, обрезав ее до одного сантиметра в диаметре. Поместите нарезанную нитроцеллюлозную бумагу на агаровую пластину, содержащую соответствующую среду.
Затем добавьте 50 микролитров разбавленной бактериальной культуры на фильтровальную бумагу, а затем добавьте 50 микролитров соответствующей среды в центр каждой поверхности образца. С помощью стерилизованного пинцета поднимите азотную целлюлозную бумагу с поверхности шнека. Осторожно переверните азотно-целлюлозную бумагу и поместите ее на поверхность образца так, чтобы бактерии контактировали с 50 микролитрами среды и интересующей наноструктурированной поверхностью.
Если образец разлагается в культуре, подложите под него держатель, чтобы поднять его, чтобы избежать контакта с трис-буфером. Поддерживайте влажность, добавляя один миллилитр трис-буфера в образец, содержащий колодец. После ночной инкубации соберите нитроцеллюлозную бумагу с каждой поверхности образца и поместите их в пять миллилитров трис-буфера.
Встряхните собранные образцы фильтровальной бумаги и наноповерхностного материала в течение пяти секунд. Соберите суспензии трис-буфера из образца и поместите их в отдельные пробирки для сбора свежих продуктов. Антимикробные эффекты с использованием метода А определили минимальную и ингибирующую концентрацию, или MIC, одного миллиграмма на миллилитр наночастиц оксида магния и минимальные бактериоцидные концентрации, или MBC 99,9, 1,0 и 1,6 миллиграмма на миллилитр наночастиц оксида магния для грамотрицательных Escherichia coli и pseudomonas aeruginosa соответственно.
Грамположительный эпидермический стафилококк, S.Aureus и метициллин-резистентный золотистый стафилококк, или MRSA, продемонстрировали значения MIC 0,5, 0,7 и один миллиграмм на миллилитр наночастиц оксида магния соответственно. Значения NBC 99,99 1,6 и 1,2 миллиграмма на миллилитр были идентифицированы для S.epidermis и S.aureus соответственно. В то время как MRSA не был снижен выше NBC 90.
MIC 1,2 и один миллиграмм на миллилитр были идентифицированы у чувствительных к лекарствам и устойчивых к лекарствам видов Candida, C. albicans и C. albicans, устойчивых к флуконазолу, или FR соответственно. Напротив, наночастицы оксида магния продемонстрировали значения MIC от одного до 0,7 миллиграмма на миллилитр, или C.glabrata и C. glabrata echinocandin resistant или ER соответственно. Каждый вид-кандидат достигал NBC 90 от 0,7 до 1,2 миллиграмма на миллилитр, но только C.glabrata ER был снижен до NBC 99,9 при 1,2 миллиграмма на миллилитр.
В методе B MRSA, подвергшийся воздействию наночастиц, экспоненциально вырос до OD 0,85. Воздействие 1,2 миллиграмма на миллилитр наночастиц оксида магния и 6,25 миллиграмма на миллилитр триметоприма привело к снижению роста бактерий на 80,2% и 81,6% соответственно. Аналогичным образом, 2,9 миллиграмма на миллилитр наночастиц гидроксида магния снижали рост бактерий до 70,3% Воздействие одного микролитра на миллилитр ванкомицина привело к снижению роста MRSA на 99,99%, что свидетельствует о бактериостатической активности наночастиц оксида магния и гидроксида магния.
Метод С не показал ингибирования роста бактерий при непрямом контакте. Результаты показали, что ZC21 обладает самой сильной антибактериальной активностью против адгезии и роста MRSA для всех протестированных образцов. В методе D жизнеспособный золотистый стафилококк не был идентифицирован в образцах 1,9A, 1,9 AA и EPD или их парной фильтровальной бумаге.
Однако воздействие образцов EPD после стояния на коленях уменьшало рост бактерий до нескольких клеток на наноструктурированной поверхности и урезанной фильтровальной бумаге. Идентификация антимикробной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей привела к дополнительным исследованиям в области биоинженерии, в том числе связанным с хроническими ранами и инфекциями, связанными с имплантатами.
