يمكن لهذا البروتوكول بسهولة توليد كرويات الزرد ، وهو نموذج 3D في المختبر مع تطبيق محتمل مختلف في اختبار سمية الأسماك. هذه طريقة بسيطة وسريعة لتوليد كرويات مفردة من خطوط خلايا الزرد متشابهة جدا في الحجم والشكل. إذا اتبعت جميع الخطوات الموضحة بشكل صحيح ، فلا ينبغي للمرء أن يواجه أي مشاكل.
قد تفيد كرويات الزرد بشكل كبير الآلية ، واستكشاف تأثيرات المواد الكيميائية على الأسماك ، مما يساعد على تحسين تقييم السلامة البيئية لمنتجات مثل مستحضرات التجميل. سيوضح الإجراء إيريسدوريس رودريغيز دي سوزا ، وهو طبيب في علم الوراثة من مختبري. للبدء ، خذ قارورة T75 من خلايا الزرد عند التقاء حوالي 80٪.
قم بإزالة الوسط الكامل ، واغسل الخلايا بإضافة 0.01 مولار PBS إلى قارورة الثقافة باستخدام ماصة. اغسل قارورة الثقافة باستخدام PBS عن طريق هز القارورة برفق ثم قم بإزالة PBS. أضف ثلاثة ملليلتر من التربسين 0.5 ملليمولار EDTA إلى قارورة الاستزراع ، واحتضانها عند 28 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.
لفصل الخلايا عن الدورق ، انقر برفق على الدورق لتحرير الخلايا. ثم أوقف هضم التربسين بإضافة ثلاثة ملليلتر من وسط الاستزراع الكامل إلى القارورة. باستخدام ماصة ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 100 جرام لمدة خمس دقائق.
ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية. أضف ملليلترا واحدا من الوسط الكامل لخط الخلية المعني قيد الاستخدام وأعد تعليق الحبيبات باستخدام ماصة صغيرة. أضف 10 ميكرولتر من معلق الخلية و 10 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء إلى أنبوب صغير لحساب الخلايا وتقييم صلاحيتها.
امزج تعليق الخلية وصبغها باستخدام ماصة ، وانقل 10 ميكرولتر من هذا الخليط إلى غرفة نيوباور. عد الخلايا في المربعات الأربعة الكبيرة أو الأرباع الموضوعة في زوايا الغرفة ، مع الأخذ في الاعتبار الخلايا التي لا تأخذ Trypan blue على أنها قابلة للحياة. ثم احسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام المعادلة الموضحة على الشاشة.
اضرب رقم الخلية هذا في اثنين لحساب رقم الخلية النهائي في تعليق الخلية. بعد حساب رقم الخلية ، اضبط تعليق الخلية على لوحة 200 ميكرولتر من هذا التعليق لكل بئر من لوحة ULA ذات القاع المستدير 96 بئرا مع عدد الخلايا المطلوبة لكل خط خلية. قم بإعداد التعليق بالتركيز المعدل للخلايا في خزان متوسط واخلطه باستخدام أنبوب دقيق متعدد القنوات دون تشكيل رغوة أو فقاعات.
أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية المعدل إلى كل بئر من لوحة ULA ذات القاع المستدير. باستخدام ماصة متعددة القنوات. يجب أن تكون اللوحة مختومة بورق بارافيلم أو رقائق مانعة للتسرب لاصقة لتجنب تبخر وسط الاستزراع من لوحة 96 بئرا.
احتضان اللوحة على شاكر مداري عند 70 دورة في الدقيقة لمدة خمسة أيام في حاضنة 28 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون. بعد خمسة أيام ، راقب الكرات تحت مجهر ضوئي مقلوب لتقييم الأجسام الكروية المتولدة. لقياس شكلها وحجمها ، احصل على صور للكرويات ، واستخدم البرامج لمعالجة الصور وتحليلها.
بعد إعداد البرنامج لقياس منطقة محددة بناء على مقياس معروف ، حدد الجانب الخارجي للكرة لتحديد مساحتها ودائريتها. يتم استخدام مساحة الكروية لتحديد حجمها عن طريق حساب القطر ، d ، ويوفر البرنامج دائرية الكروية بواسطة صيغة تستخدم المساحة والمحيط المحددين. يتم تشكيل مجموع خلايا ZFL في اليوم الأول من الاهتزاز المداري.
يزيد مجموع الخلية من دائريته في اليوم الثالث ، ويصل إلى شكل كروي مناسب في اليوم الخامس. يظهر هنا كروي ZFL يبلغ من العمر 16 يوما في لوحة ULA. يشكل خط خلية ZEM2S كرويات من اليوم الأول للاهتزاز المداري.
يحافظ الكروي على شكله ويزداد حجمه في اليوم الثالث ، ويتم الوصول إلى أقصى دائرية له في اليوم الخامس. يظهر هنا كروي ZEM2S عمره 10 أيام في لوحة ULA. يظهر في هذا الشكل الحجم المقاس للكرويات لخطوط خلايا ZFL و ZEM2S ومؤشر الدائرية المقاس للكرويات ZFL و ZEM2S.
تمثل هذه الصورة الرسومية نمط نمو الأجسام الكروية ZFL و ZEM2S. يظهر هنا كروي ZFL وكروي ZEM2S تشكلت بعد خمسة أيام من الاهتزاز المداري عند 100 دورة في الدقيقة. يتم عرض نمط النمو ومؤشر الدائرية للكرويات المتكونة عند سرعات دوران 70 و 100 دورة في الدقيقة في هذا الشكل.
70 دورة في الدقيقة هي السرعة الأكثر ملاءمة لتشكيل كرويات ZFL و ZEM2S بهذه الطريقة. يوضح تلطيخ أغشية الخلايا بواسطة Lectin Alexa Fluor 594 والنوى بواسطة DAPI السلامة الخلوية في قلب الأجسام الكروية. يوضح مضان الريسوروفين الذي يتكون من تقليل AlamarBlue خلايا قابلة للحياة في قلب كل من الكرويات.
يتم عرض مقايسة جدوى MTT في ثقافة 3D وثقافة 2D لخط خلية ZEM2S و ZFL هنا ، مما يدل على عدم وجود اختلافات ذات دلالة إحصائية. عند محاولة هذا الإجراء ، تأكد من إغلاق الألواح لتجنب تغيير درجة الحموضة في وسائط الاستزراع والتبخر في الآبار. يمكن تطبيق الكرات في مجموعة متنوعة من المقايسات في المختبر لتقييم التأثيرات السامة في كبد السمك أو الدراسات التنموية باستخدام خط خلية ZEM2S الجنيني.
يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في دفع تطوير اختبار الأسماك في المختبر ، مما يساهم في تقدم دراسات السمية البيئية غير الحيوانية.
