Este protocolo pode facilmente gerar esferoides de zebrafish, um modelo 3D in vitro com diferentes potenciais aplicações em testes de toxicidade em peixes. Este é um método simples e rápido para gerar esferoides únicos de linhagens celulares de peixe-zebra muito semelhantes em tamanho e forma. Se você seguir todas as etapas descritas corretamente, não se deve encontrar problemas.
Os esferoides do peixe-zebra podem beneficiar muito o mecanismo, a exploração dos efeitos dos produtos químicos nos peixes, o que ajuda a melhorar a avaliação da segurança ambiental de produtos como cosméticos. Quem vai demonstrar o procedimento será Irisdoris Rodrigues de Souza, doutora em genética pelo meu laboratório. Para começar, pegue um frasco T75 de células de peixe-zebra em torno de 80% de confluência.
Retirar o meio completo e lavar as células adicionando PBS 0,01 molar ao frasco de cultura com uma pipeta. Lavar o balão de cultura com PBS agitando suavemente o balão e, em seguida, retirar o PBS. Adicionar três mililitros de EDTA 0,5 milimolar de tripsina ao balão de cultura e incubar a 28 graus Celsius durante três minutos.
Para o descolamento das células do frasco, toque suavemente no balão para libertar as células. E, em seguida, parar a digestão de tripsina adicionando três mililitros de meio de cultura completo ao frasco. Usando uma pipeta, transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros e centrífuga a 100 G por cinco minutos.
Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante. Adicione um mililitro do meio completo para a respectiva linha celular em uso e ressuspenda o pellet usando uma micropipeta. Adicione 10 microlitros da suspensão celular e 10 microlitros de corante azul de Trypan a um microtubo para contar as células e avaliar sua viabilidade.
Misture a suspensão celular e o corante usando uma pipeta e transfira 10 microlitros dessa mistura para uma câmara de Neubauer. Conte as células nos quatro grandes quadrados ou quadrantes colocados nos cantos da câmara, considerando viáveis as células que não utilizam o azul de Trypan. Em seguida, calcule o número de células viáveis usando a equação mostrada na tela.
Multiplique esse número de célula por dois para calcular o número final de célula na suspensão de célula. Depois de calcular o número de células, ajuste a suspensão celular para a placa de 200 microlitros dessa suspensão por poço de uma placa ULA de fundo redondo de 96 poços com o número de células necessárias para cada linha celular. Prepare a suspensão com a concentração ajustada de células em um reservatório médio e misture-a usando uma micropipeta multicanal sem formar espuma ou bolhas.
Adicione 200 microlitros da suspensão celular ajustada a cada poço da placa ULA de fundo redondo. usando uma pipeta multicanal. A placa deve ser selada com Parafilm ou folha de vedação adesiva para evitar a evaporação do meio de cultura da placa de 96 poços.
Incubar a placa em um agitador orbital a 70 RPM por cinco dias em uma incubadora de 28 graus Celsius sem dióxido de carbono. Após cinco dias, observar os esferoides em microscópio de luz invertida para avaliar os esferoides gerados. Para medir sua forma e tamanho, obtenha fotos dos esferoides e use um software para processar e analisar as imagens.
Depois de configurar o software para medir uma área selecionada com base em uma escala conhecida, selecione o lado externo do esferoide para determinar sua área e circularidade. A área do esferoide é usada para determinar seu tamanho calculando o diâmetro, d, e o software fornece a circularidade do esferoide por uma fórmula que usa a área e o perímetro selecionados. Um agregado celular ZFL é formado no primeiro dia de agitação orbital.
O agregado celular aumenta sua circularidade no terceiro dia, e atinge uma forma esferoidal adequada no quinto dia. Um esferoide ZFL de 16 dias na placa ULA é mostrado aqui. A linhagem celular ZEM2S forma esferoides a partir do primeiro dia de agitação orbital.
O esferoide mantém sua forma e aumenta de tamanho no terceiro dia, e sua circularidade máxima é atingida no quinto dia. Um esferoide ZEM2S de 10 dias em uma placa ULA é mostrado aqui. O tamanho medido dos esferoides das linhagens celulares ZFL e ZEM2S e o índice de circularidade medido dos esferoides ZFL e ZEM2S são mostrados nesta figura.
Esta imagem gráfica representa o padrão de crescimento dos esferoides ZFL e ZEM2S. Um esferoide ZFL e um esferoide ZEM2S formados após cinco dias de agitação orbital a 100 RPM são mostrados aqui. O padrão de crescimento e o índice de circularidade dos esferoides formados nas velocidades de rotação de 70 e 100 RPM são apresentados nesta figura.
70 RPM é a velocidade mais adequada para formar esferoides ZFL e ZEM2S por este método. A coloração das membranas celulares pela lectina Alexa Fluor 594 e núcleos pela DAPI demonstra a integridade celular no núcleo dos esferoides. A fluorescência da resorufina formada por uma redução de AlamarBlue demonstra células viáveis no núcleo de ambos os esferoides.
O ensaio de viabilidade do MTT em cultura 3D e cultura 2D da linhagem celular ZEM2S e ZFL é mostrado aqui, demonstrando que não há diferenças significativas. Ao tentar este procedimento, certifique-se de selar as placas para evitar a alteração do pH do meio de cultura e a evaporação nos poços. Os esferoides podem ser aplicados em uma variedade de ensaios in vitro para avaliar efeitos tóxicos no fígado de peixes ou estudos de desenvolvimento usando a linhagem celular embrionária ZEM2S.
Este protocolo pode ajudar a impulsionar o desenvolvimento de testes in vitro em peixes, contribuindo para o progresso de estudos de ecotoxicidade não baseados em animais.
