Questo protocollo può facilmente generare sferoidi zebrafish, un modello 3D in vitro con diverse potenziali applicazioni nei test di tossicità dei pesci. Questo è un metodo semplice e veloce per generare singoli sferoidi di linee cellulari di zebrafish molto simili per dimensioni e forma. Se si seguono correttamente tutti i passaggi descritti, non si dovrebbero riscontrare problemi.
Gli sferoidi zebrafish possono essere di grande beneficio per il meccanismo, l'esplorazione degli effetti delle sostanze chimiche sui pesci, che aiuta a migliorare la valutazione della sicurezza ambientale di prodotti come i cosmetici. A dimostrare la procedura sarà Irisdoris Rodrigues de Souza, un medico in genetica del mio laboratorio. Per iniziare, prendi un matraccio T75 di cellule di zebrafish a circa l'80% di confluenza.
Rimuovere il mezzo completo e lavare le cellule aggiungendo PBS molare 0,01 al pallone di coltura con un pipet. Lavare il pallone di coltura con PBS agitando delicatamente il pallone e quindi rimuovere il PBS. Aggiungere tre millilitri di tripsina 0,5 millimolare EDTA al pallone di coltura e incubare a 28 gradi Celsius per tre minuti.
Per il distacco delle cellule dal pallone, picchiettare delicatamente il pallone per rilasciare le cellule. E poi interrompere la digestione della tripsina aggiungendo tre millilitri di terreno di coltura completo al pallone. Utilizzando un pipet, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da centrifuga conica da 15 millilitri e centrifugare a 100 G per cinque minuti.
Quindi rimuovere con attenzione il surnatante. Aggiungere un millilitro del mezzo completo per la rispettiva linea cellulare in uso e risospendere il pellet utilizzando un micropipet. Aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare e 10 microlitri di colorante blu Trypan a un micro tubo per contare le cellule e valutare la loro vitalità.
Mescolare la sospensione cellulare e colorare usando un pipet e trasferire 10 microlitri di questa miscela in una camera Neubauer. Contare le celle nei quattro grandi quadrati o quadranti posti agli angoli della camera, considerando le cellule che non assorbono il blu di Trypan come vitali. Quindi calcolare il numero di celle vitali utilizzando l'equazione mostrata sullo schermo.
Moltiplicare questo numero di cella per due per calcolare il numero di cella finale nella sospensione di cella. Dopo aver calcolato il numero di celle, regolare la sospensione della cella sulla piastra 200 microlitri di questa sospensione per pozzetto di una piastra ULA inferiore rotonda a 96 pozzetti con il numero di celle necessarie per ciascuna linea cellulare. Preparare la sospensione con la concentrazione regolata di cellule in un serbatoio medio e mescolarla usando un micropipet multicanale senza formare schiuma o bolle.
Aggiungere 200 microlitri della sospensione cellulare regolata a ciascun pozzetto della piastra ULA inferiore rotonda. utilizzando una pipetta multicanale. La piastra deve essere sigillata con Parafilm o pellicola sigillante adesiva per evitare l'evaporazione del terreno di coltura dalla piastra a 96 pozzetti.
Incubare la piastra su uno shaker orbitale a 70 RPM per cinque giorni in un incubatore a 28 gradi Celsius senza anidride carbonica. Dopo cinque giorni, osservare gli sferoidi al microscopio a luce invertita per valutare gli sferoidi generati. Per misurare la loro forma e dimensione, ottenere immagini degli sferoidi e utilizzare il software per elaborare e analizzare le immagini.
Dopo aver impostato il software per misurare un'area selezionata in base a una scala nota, selezionare il lato esterno dello sferoide per determinarne l'area e la circolarità. L'area dello sferoide viene utilizzata per determinare la sua dimensione calcolando il diametro, d, e il software fornisce la circolarità dello sferoide con una formula che utilizza l'area e il perimetro selezionati. Un aggregato di cellule ZFL si forma il primo giorno di scuotimento orbitale.
L'aggregato cellulare aumenta la sua circolarità il terzo giorno e raggiunge un'adeguata forma sferoidale il quinto giorno. Uno sferoide ZFL di 16 giorni in piastra ULA è mostrato qui. La linea cellulare ZEM2S forma sferoidi dal primo giorno di scuotimento orbitale.
Lo sferoide mantiene la sua forma e aumenta di dimensioni il terzo giorno, e la sua massima circolarità viene raggiunta il quinto giorno. Uno sferoide ZEM2S di 10 giorni in una piastra ULA è mostrato qui. La dimensione misurata degli sferoidi delle linee cellulari ZFL e ZEM2S e l'indice di circolarità misurato degli sferoidi ZFL e ZEM2S sono mostrati in questa figura.
Questa immagine grafica rappresenta il modello di crescita degli sferoidi ZFL e ZEM2S. Uno sferoide ZFL e uno sferoide ZEM2S formati dopo cinque giorni di scuotimento orbitale a 100 RPM sono mostrati qui. Il modello di crescita e l'indice di circolarità degli sferoidi formati a velocità di rotazione di 70 e 100 RPM sono presentati in questa figura.
70 RPM è la velocità più adeguata per formare sferoidi ZFL e ZEM2S con questo metodo. La colorazione delle membrane cellulari da parte di Lectin Alexa Fluor 594 e dei nuclei da parte di DAPI dimostra l'integrità cellulare nel nucleo degli sferoidi. La fluorescenza di resorufin formata da una riduzione di AlamarBlue dimostra cellule vitali nel nucleo di entrambi gli sferoidi.
Il saggio di vitalità MTT in coltura 3D e coltura 2D della linea cellulare ZEM2S e ZFL è mostrato qui, dimostrando che non ci sono differenze significative. Quando si tenta questa procedura, assicurarsi di sigillare le piastre per evitare di modificare il pH dei terreni di coltura e l'evaporazione nei pozzetti. Gli sferoidi possono essere applicati in una varietà di saggi in vitro per valutare gli effetti tossici nel fegato di pesce o studi sullo sviluppo utilizzando la linea cellulare embrionale ZEM2S.
Questo protocollo può aiutare a portare avanti lo sviluppo di test ittici in vitro, contribuendo al progresso degli studi di ecotossicità senza animali.
