该协议可以轻松生成斑马鱼球状体，这是一种3D体外模型，在鱼类毒性测试中具有不同的潜在应用。这是一种简单快速的方法，可以生成大小和形状非常相似的斑马鱼细胞系的单个球状体。如果您正确执行所有描述的步骤，则应该不会遇到任何问题。
斑马鱼球状体提供的机理，探索化学物质对鱼类的影响，有助于提高化妆品等产品的环境安全评价。展示该程序的将是Irisdoris Rodrigues de Souza，我实验室的遗传学博士。首先，取一瓶T75烧瓶的斑马鱼细胞，汇合度约为80%。
除去完整的培养基，并通过用移液管向培养瓶中加入0.01摩尔PBS来洗涤细胞。用PBS轻轻摇动培养瓶清洗培养瓶，然后取出PBS。向培养瓶中加入三毫升胰蛋白酶0.5毫摩尔EDTA，并在28摄氏度下孵育3分钟。
为了从烧瓶中分离细胞，轻轻敲击烧瓶以释放细胞。然后通过向烧瓶中加入三毫升完全培养基来停止胰蛋白酶消化。使用移液管将细胞悬液转移到15毫升锥形离心管中，并以100 G离心5分钟。
然后小心地除去上清液。为使用的相应细胞系添加一毫升完整培养基，并使用微量移液管重悬沉淀。向微管中加入10微升细胞悬液和10微升台盼蓝染料以计数细胞并评估其活力。
使用移液管混合细胞悬液和染料，并将10微升该混合物转移到Neubauer室中。计算放置在腔室角落的四个大方块或象限中的细胞，认为不吸收台盼蓝的细胞是可行的。然后使用屏幕上显示的方程式计算活细胞的数量。
将此细胞数乘以 2 以计算细胞悬液中的最终细胞数。计算细胞数后，将细胞悬液调整为96孔圆底ULA板每孔200微升该悬浮液，每个细胞系所需的细胞数。在培养基储液槽中用调节后的细胞浓度制备悬浮液，并使用多通道微量移液器混合，而不会形成泡沫或气泡。
向圆底ULA板的每个孔中加入200微升调整后的细胞悬液。使用多通道移液器。板必须用封口膜或粘合剂密封箔密封，以避免培养基从 96 孔板蒸发。
将板在 70 RPM 的轨道振荡器上在不含二氧化碳的 28 摄氏度培养箱中孵育五天。五天后，在倒置光学显微镜下观察微球以评估生成的微球。要测量它们的形状和大小，获取微球的图片，并使用软件处理和分析图像。
将软件设置为根据已知比例测量所选区域后，选择椭球体的外侧以确定其面积和圆度。椭球体的面积用于通过计算直径 d 来确定其大小，软件通过使用所选面积和周长的公式提供椭球体的圆度。ZFL细胞聚集体在轨道振荡的第一天形成。
细胞聚集体在第三天增加其圆度，并在第五天达到足够的球状。图中显示了ULA板中16天大的ZFL球体。ZEM2S细胞系从眼眶振荡的第一天开始形成球状体。
球体在第三天保持其形状并增加尺寸，并在第五天达到其最大圆度。图中显示了ULA板中10天大的ZEM2S球体。ZFL和ZEM2S细胞系的微球尺寸测量值以及ZFL和ZEM2S球体的圆度指数测量值如图所示。
此图形图像表示 ZFL 和 ZEM2S 球体的生长模式。此处显示了在 100 RPM 下振荡五天后形成的 ZFL 椭球体和 ZEM2S 椭球体。图中显示了在70和100 RPM转速下形成的球体的生长模式和圆度指数。
70 RPM 是用这种方法形成 ZFL 和 ZEM2S 球体的最合适速度。凝集素Alexa Fluor 594的细胞膜染色和DAPI的细胞核染色证明了球状体核心的细胞完整性。由AlamarBlue还原形成的试卤灵荧光显示两个球状体的核心中有活细胞。
此处显示了 ZEM2S 和 ZFL 细胞系的 3D 培养和 2D 培养中的 MTT 活力测定，证明没有显着差异。尝试此过程时，请确保密封板，以避免改变培养基的pH值和孔中的蒸发。球状体可用于各种体外测定，以评估鱼肝中的毒性作用或使用胚胎ZEM2S细胞系进行发育研究。
该协议有助于推动体外鱼类试验的发展，有助于无动物生态毒性研究的进展。
