이 프로토콜은 어류 독성 테스트에서 다양한 잠재적 응용 분야를 가진 3D 체외 모델인 제브라피쉬 스페로이드를 쉽게 생성할 수 있습니다. 이것은 크기와 모양이 매우 유사한 제브라피쉬 세포주의 단일 스페로이드를 생성하는 간단하고 빠른 방법입니다. 설명 된 모든 단계를 올바르게 수행하면 문제가 발생하지 않습니다.
Zebrafish 스페로이드는 화장품과 같은 제품의 환경 안전성 평가를 개선하는 데 도움이 되는 물고기에 대한 화학 물질의 영향 탐색에 큰 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 유전학 의사 인 Irisdoris Rodrigues de Souza가 될 것입니다. 시작하려면 약 80%의 합류점에서 제브라피쉬 세포의 T75 플라스크를 가져옵니다.
완전한 배지를 제거하고, 피펫으로 배양 플라스크에 0.01 몰 PBS를 첨가하여 세포를 세척하였다. 배양 플라스크를 PBS로 세척하고 플라스크를 부드럽게 흔들어 PBS를 제거한다. 트립신 0.5 밀리몰 EDTA 3 밀리리터를 배양 플라스크에 첨가하고, 섭씨 28도에서 3 분 동안 배양한다.
플라스크에서 세포를 분리하려면 플라스크를 부드럽게 두드려 세포를 분리합니다. 그런 다음 플라스크에 3 밀리리터의 완전 배양 배지를 첨가하여 트립신 소화를 중지합니다. 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15 밀리리터 원추형 원심 분리 튜브로 옮기고 100G에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
그런 다음 상청액을 조심스럽게 제거하십시오. 사용 중인 각 세포주에 대해 완전한 배지 1밀리리터를 추가하고 마이크로피펫을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 10 마이크로리터의 세포 현탁액과 10 마이크로리터의 트리판 블루 염료를 마이크로 튜브에 첨가하여 세포를 계수하고 생존력을 평가합니다.
피펫을 사용하여 세포 현탁액과 염료를 혼합하고, 이 혼합물 10 마이크로리터를 노이바우어 챔버로 옮긴다. 챔버 모서리에 배치된 4개의 큰 정사각형 또는 사분면의 세포를 세고, 트리판 블루를 차지하지 않는 세포를 생존 가능한 것으로 간주합니다. 그런 다음 화면에 표시된 방정식을 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다.
이 세포 번호에 2를 곱하여 세포 현탁액의 최종 세포 수를 계산합니다. 세포 수를 계산한 후, 세포 현탁액을 각 세포주에 필요한 세포 수와 함께 96-웰 둥근 바닥 ULA 플레이트의 웰 당 200 마이크로리터의 플레이트로 조정하였다. 중간 저장소에서 조정 된 농도의 세포로 현탁액을 준비하고 거품이나 기포를 형성하지 않고 다중 채널 마이크로 피펫을 사용하여 혼합합니다.
200 마이크로리터의 조정된 세포 현탁액을 둥근 바닥 ULA 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 다중 채널 피펫 사용. 플레이트는 96웰 플레이트에서 배양 배지가 증발하는 것을 방지하기 위해 Parafilm 또는 접착 밀봉 호일로 밀봉해야 합니다.
플레이트를 이산화탄소 없이 섭씨 28도의 인큐베이터에서 5일 동안 70RPM의 궤도 셰이커에서 배양합니다. 5일 후, 생성된 스페로이드를 평가하기 위해 도립 광학 현미경으로 스페로이드를 관찰합니다. 스페로이드의 모양과 크기를 측정하려면 스페로이드의 사진을 얻고 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리하고 분석합니다.
알려진 스케일을 기반으로 선택한 영역을 측정하도록 소프트웨어를 설정한 후 스페로이드의 바깥쪽을 선택하여 영역과 원형을 결정합니다. 스페로이드의 면적은 지름 d를 계산하여 크기를 결정하는 데 사용되며, 소프트웨어는 선택한 면적과 둘레를 사용하는 공식으로 스페로이드의 원형을 제공합니다. ZFL 세포 응집체는 궤도 흔들림의 첫날에 형성됩니다.
세포 응집체는 3일째에 원형을 증가시키고 5일째에 적절한 구상 모양에 도달합니다. ULA 플레이트의 16일 된 ZFL 스페로이드가 여기에 표시됩니다. ZEM2S 세포주는 안와 진탕 첫날부터 스페로이드를 형성합니다.
스페로이드는 3일째에 모양을 유지하고 크기가 증가하며 5일째에 최대 원형도에 도달합니다. ULA 플레이트에 있는 10일 된 ZEM2S 스페로이드가 여기에 나와 있습니다. ZFL 및 ZEM2S 세포주의 측정된 스페로이드 크기와 ZFL 및 ZEM2S 스페로이드의 측정된 원형도 지수가 이 그림에 나와 있습니다.
이 그래픽 이미지는 ZFL 및 ZEM2S 스페로이드의 성장 패턴을 나타냅니다. 100RPM에서 5일 동안 궤도를 흔들어 형성한 ZFL 스페로이드와 ZEM2S 스페로이드가 여기에 나와 있습니다. 70 및 100 RPM 회전 속도에서 형성된 스페로이드의 성장 패턴과 원형도 지수가 이 그림에 나와 있습니다.
70RPM은 이 방법으로 ZFL 및 ZEM2S 스페로이드를 형성하는 데 가장 적합한 속도입니다. 렉틴(Lectin), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 594에 의한 세포막 염색 및 DAPI에 의한 핵의 염색은 스페로이드 코어의 세포 무결성을 입증합니다. AlamarBlue의 감소에 의해 형성된 레조루핀의 형광은 두 스페로이드의 코어에서 생존 가능한 세포를 보여줍니다.
ZEM2S 및 ZFL 세포주의 3D 배양 및 2D 배양에서의 MTT 생존율 분석이 여기에 나타나 있으며, 이는 유의미한 차이가 없음을 보여줍니다. 이 절차를 시도할 때 배양 배지의 pH가 변경되고 웰에서 증발하지 않도록 플레이트를 밀봉해야 합니다. 스페로이드는 배아 ZEM2S 세포주를 사용한 어류 간 또는 발달 연구에서 독성 효과를 평가하기 위한 다양한 시험관 내 분석에 적용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 시험관 내 어류 테스트의 개발을 촉진하는 데 도움이 될 수 있으며, 동물 기반 생태 독성 연구의 진행에 기여할 수 있습니다.
