Este protocolo puede generar fácilmente esferoides de pez cebra, un modelo 3D in vitro con diferente aplicación potencial en pruebas de toxicidad de peces. Este es un método simple y rápido para generar esferoides individuales de líneas celulares de pez cebra muy similares en tamaño y forma. Si sigue todos los pasos descritos correctamente, uno no debería encontrar ningún problema.
Los esferoides del pez cebra pueden beneficiar enormemente el mecanismo, la exploración de los efectos de los productos químicos en los peces, lo que ayuda a mejorar la evaluación de la seguridad ambiental de productos como los cosméticos. Demostrando el procedimiento estará Irisdoris Rodrigues de Souza, doctora en genética de mi laboratorio. Para empezar, tome un matraz T75 de células de pez cebra en torno al 80% de confluencia.
Retirar el medio completo y lavar las células añadiendo 0,01 PBS molares al matraz de cultivo con una pipeta. Lavar el matraz de cultivo con PBS agitándolo suavemente y, a continuación, retirar el PBS. Añadir tres mililitros de tripsina 0,5 milimolar EDTA al matraz de cultivo e incubar a 28 grados centígrados durante tres minutos.
Para desprender las células del matraz, golpee suavemente el matraz para liberar las células. Y luego detener la digestión de tripsina agregando tres mililitros de medio de cultivo completo al matraz. Con una pipeta, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros y centrifuga a 100 G durante cinco minutos.
Luego retire con cuidado el sobrenadante. Agregue un mililitro del medio completo para la línea celular respectiva en uso y resuspenda el pellet usando una micropipeta. Agregue 10 microlitros de la suspensión celular y 10 microlitros de colorante azul de tripán a un microtubo para contar las células y evaluar su viabilidad.
Mezclar la suspensión celular y el tinte con una pipeta, y transferir 10 microlitros de esta mezcla a una cámara Neubauer. Contar las celdas en los cuatro cuadrados grandes o cuadrantes colocados en las esquinas de la cámara, considerando viables las celdas que no absorben el azul de tripano. Luego calcule el número de celdas viables usando la ecuación que se muestra en la pantalla.
Multiplique este número de celda por dos para calcular el número de celda final en la suspensión de celdas. Después de calcular el número de celdas, ajuste la suspensión celular a la placa 200 microlitros de esta suspensión por pocillo de una placa ULA de fondo redondo de 96 pocillos con el número de celdas requeridas para cada línea celular. Preparar la suspensión con la concentración ajustada de células en un depósito medio y mezclarla con una micropipeta multicanal sin formar espuma ni burbujas.
Agregue 200 microlitros de la suspensión celular ajustada a cada pocillo de la placa ULA de fondo redondo. utilizando una pipeta multicanal. La placa debe sellarse con Parafilm o lámina de sellado adhesiva para evitar la evaporación del medio de cultivo de la placa de 96 pocillos.
Incubar la placa en un agitador orbital a 70 RPM durante cinco días en una incubadora de 28 grados centígrados sin dióxido de carbono. Después de cinco días, observe los esferoides bajo un microscopio de luz invertida para evaluar los esferoides generados. Para medir su forma y tamaño, obtenga imágenes de los esferoides y use software para procesar y analizar las imágenes.
Después de configurar el software para medir un área seleccionada en función de una escala conocida, seleccione el lado exterior del esferoide para determinar su área y circularidad. El área del esferoide se utiliza para determinar su tamaño calculando el diámetro, d, y el software proporciona la circularidad del esferoide mediante una fórmula que utiliza el área y el perímetro seleccionados. Un agregado de células ZFL se forma el primer día de agitación orbital.
El agregado celular aumenta su circularidad en el tercer día, y alcanza una forma esferoidal adecuada en el día cinco. Aquí se muestra un esferoide ZFL de 16 días de edad en la placa ULA. La línea celular ZEM2S forma esferoides desde el primer día de agitación orbital.
El esferoide mantiene su forma y aumenta de tamaño al tercer día, y su máxima circularidad se alcanza en el quinto día. Aquí se muestra un esferoide ZEM2S de 10 días de edad en una placa ULA. El tamaño medido de los esferoides de las líneas celulares ZFL y ZEM2S y el índice de circularidad medido de los esferoides ZFL y ZEM2S se muestran en esta figura.
Esta imagen gráfica representa el patrón de crecimiento de los esferoides ZFL y ZEM2S. Aquí se muestra un esferoide ZFL y un esferoide ZEM2S formados después de cinco días de sacudida orbital a 100 RPM. El patrón de crecimiento y el índice de circularidad de los esferoides formados a velocidades de rotación de 70 y 100 RPM se presentan en esta figura.
70 RPM es la velocidad más adecuada para formar esferoides ZFL y ZEM2S por este método. La tinción de las membranas celulares por Lectina Alexa Fluor 594 y núcleos por DAPI demuestra la integridad celular en el núcleo de los esferoides. La fluorescencia de la resorufina formada por una reducción de AlamarBlue demuestra células viables en el núcleo de ambos esferoides.
Aquí se muestra el ensayo de viabilidad MTT en cultivo 3D y cultivo 2D de la línea celular ZEM2S y ZFL, demostrando que no hay diferencias significativas. Al intentar este procedimiento, asegúrese de sellar las placas para evitar cambiar el pH de los medios de cultivo y la evaporación en los pocillos. Los esferoides se pueden aplicar en una variedad de ensayos in vitro para evaluar los efectos tóxicos en el hígado de pescado o estudios de desarrollo utilizando la línea celular ZEM2S del embrión.
Este protocolo puede ayudar a impulsar el desarrollo de pruebas in vitro con peces, contribuyendo al progreso de los estudios de ecotoxicidad sin animales.
