النبوءات هي عاثيات بكتيرية اندمجت في الجينومات البكتيرية. نحن نستخدم نهجا نسخيا لاستكشاف تأثير النبوءات بشكل شامل على بيولوجيا مضيفيها البكتيريين. تتناول الطرق الموصوفة هنا التحدي الرئيسي المتمثل في الحث التلقائي لدورة الانحلال النبوء.
يتيح التحسين الدقيق لظروف الاستزراع التنميط النظيف للتعبير الجيني أثناء حالة النبوء. تم العثور على النبوءات في معظم مسببات الأمراض البكتيرية ، ولكن لا يتم فهم الأهمية عادة. يمكن لهذه الأدوات إلقاء الضوء على دور النبوءات كمنظم لوظائف بكتيرية متعددة.
هناك علاقات مضيف نبوءة لا حدود لها تقريبا لا تزال غير مدروسة. يمثل هذا موردا ضخما غير مستغل للأهداف العلاجية المحتملة التي يمكن أن تساعد هذه البروتوكولات في التنبؤ بها. يتمثل التحدي الرئيسي في إيجاد حالة الثقافة المناسبة لتحقيق التوازن بين نمو الليزوجين والحث التلقائي للنبوء.
التحدي الثانوي المعروف ، ليسون ، الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي لدراسات المصب. للبدء في إعداد اللايسوجين الطازج والثقافات المضيفة للمؤشر عن طريق تلقيح الثقافات الليلية في 100 ملليلتر من LB بنسبة واحد إلى 100. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 180 دورة في الدقيقة.
لمراقبة نمو الليزوجين ، اجمع عينة ملليلتر واحد كل ساعة من نقطة التلقيح لمدة ثماني ساعات. بشكل متسلسل ، قم بتخفيف الثقافة بإضافة 100 ميكرولتر إلى 900 ميكرولتر من وسط الجهد المنخفض. دوامة بأقصى سرعة ، واستمر في سلسلة التخفيف من 10 إلى ناقص واحد إلى 10 إلى ناقص تسعة.
ضع 10 ميكرولتر من التخفيف المطلوب على لوحة مثقاب LB. اتركيه حتى يجف واحتضانه عند 30 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة. بعد الحضانة ، احسب عدد المستعمرات واحسب عدد الخلايا البكتيرية القابلة للحياة باستخدام الصيغة المحددة.
بعد ذلك ، لتعداد جزيئات العاثيات المعدية في العينة الزمنية ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المضيفة لمؤشر مقاومة الريفامبيسين في المرحلة اللوغاريتمية إلى البريمة العلوية المنصهرة ، جنبا إلى جنب مع ريفامبيسين. ضع 10 ميكرولتر من مزرعة الليزوجين المخففة بشكل متسلسل على طبقة البريمة العلوية الملقحة. يسمح ليجف ، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة.
بعد الحضانة ، احسب عدد اللويحات واحسب جزيئات العاثيات المعدية باستخدام الصيغة المحددة. قم بتسمية القارورة الأولى على أنها غير مستحثة والأخرى على أنها مستحثة ، جنبا إلى جنب مع النقاط الزمنية التي يجب فيها حصاد كل عينة. ثم استزراع الثقافات المحللة المزروعة بين عشية وضحاها في 80 ملليلتر من LB بنسبة واحد إلى 100 في ثماني قوارير 250 ملليلتر.
احتضان القوارير عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 180 دورة في الدقيقة. بعد 90 دقيقة ، عندما تكون الكثافة البصرية عند 600 نانومتر بين 0.1 و 0.2 ، أضف أربعة ميكرولترات من حمض الأسيتيك الجليدي 1٪ إلى القارورة غير المستحثة. أضف مزرعة 80 ملليلتر من القارورة غير المستحثة إلى 720 ملليلتر من LB وأضف على الفور 160 ملليلتر من محلول التوقف قبل وضع القارورة على الجليد لمدة 30 دقيقة لتثبيت نسخ الحمض النووي الريبي.
بعد ذلك ، أضف النورفلوكساسين بتركيز نهائي قدره ميكروغرام واحد لكل ملليلتر إلى القارورة المستحثة التي تحتوي على 80 ملليلتر من الثقافة. تخلط جيدا وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 180 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة. اسمح للخلايا بالتعافي عن طريق إضافة 80 ملليلتر من المزرعة المستحثة إلى 720 ملليلتر من LB. احصد الخلايا البكتيرية من كل قارورة كل 10 دقائق من صفر إلى ساعة واحدة عن طريق إضافة محلول توقف.
أجهزة الطرد المركزي في 10،000 G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية وتجاهل طاف. قبل إعادة تعليق الحبيبات برفق في السائل المتبقي باستخدام الماصة الأوتوماتيكية القابلة للتعديل. نقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 13،000 G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية.
تخلص من المادة الطافية المتبقية وأغلق أنبوب الميكروفوج ، قبل تجميد الكريات في النيتروجين السائل. أضف ملليلترا واحدا من Trizol إلى كل حبيبة مجمدة ، وقم بتجانس التعليق عن طريق الماصة. بعد تحديد مجموعة من الجينات المستهدفة التي يمكن أن تعمل كعلامات لكل مرحلة من مراحل تكرار العاثية محل الاهتمام ، قم بتضخيم كل جين من الجينات المستهدفة من الحمض النووي الجينومي باستخدام البادئات ذات الصلة.
قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام شروط التضخيم الموضحة في المخطوطة النصية. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، باستخدام مجموعة تنقية PCR ، قم بتنقية كل amplicon واستنساخها في ناقل استنساخ TA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تحقق من تسلسل كل منتج مستنسخ عن طريق تسلسل سانجر.
بعد حساب عدد نسخ أربعة بلازميدات فردية ، قم بإعداد قالب قياسي لكل جين علامة عن طريق تخفيف الحمض النووي للبلازميد بشكل متسلسل في الماء الخالي من النيوكلياز. أضف ميكرولتر واحد من CDNA ومعايير البلازميد ذات الصلة لكل هدف في لوحة بئر 96. وإجراء PCR الكمي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
بعد PCR ، استخدم برنامج Excel لرسم رقم نسخة الحمض النووي للسجل مقابل عتبة الدورة. قم بإجراء حساب الانحدار الخطي لعرض معامل التحديد والمعادلة الخطية. بعد ذلك ، قم بتقدير رقم النسخ لكل هدف باستخدام المعادلة الخطية المشتقة من الانحدار الخطي.
ثم احسب فعالية تضخيم PCR باستخدام المعلمات من الانحدار الخطي للمنحنى القياسي والمعادلة المحددة. بعد التحقق من صحة البادئات من حيث كفاءتها المئوية ، احسب عدد النسخ المطلق للحمض النووي. اقترح التعداد الزمني لإنتاج نبوءة أقل تلقائية أقل أرقام PFU لكل خلية في ساعتين وأعلى أرقام PFU لكل خلية في ست ساعات.
ثم كان الليزوجين أكثر استقرارا عند ساعتين. لذلك تم استخدام هذا الشرط لتوصيف QRTPCR. لوحظت زيادة ملحوظة في التعبير عن جين cro ، وهو علامة مبكرة للتكرار الليتي من 2.31 مرة 10 إلى النسخ التاسعة في الثقافات غير المستحثة إلى 3.02 مرة 10 إلى 11 نسخة بعد 30 دقيقة من الاستقراء.
وبالمثل ، أظهرت بروتينات P و O ، وهي علامة منتصف المرحلة للتكرار الليتيكي ، تنظيما كبيرا من 1.74 مرة 10 إلى الثامنة إلى 1.25 مرة 10 إلى النسخ العاشرة ، ومن 6.05 مرة 10 إلى الثانية إلى 5.68 مرة 10 إلى النسخ الخامسة على التوالي. أظهرت العلامة المتأخرة لدورة النسخ المتماثل زيادة كبيرة في التعبير في الثقافات غير المستحثة إلى 30 دقيقة بعد الاستقراء. من بين الضوابط الداخلية التي تم اختبارها ، كان لدى RPOD التعبير الأكثر استقرارا مقارنة ب 16 جينا SRNA أو ProC.
بالمقارنة مع علامات التكرار الليتيكي ، كان التعبير عن جين C-one مستقرا نسبيا. ومع ذلك ، كان عدد نسخ الجين C-one مرتفعا بشكل مطمئن في الثقافات غير المستحثة ، مقارنة بعلامات التكرار الليتيكي. لا يمكن أن تأتي أي بيانات أو تفسيرات جيدة من مكتبة RNA سيئة الإعداد.
السيطرة على الحث التلقائي وسلامة الحمض النووي الريبي هي أهم الأشياء. يمكن دراسة الديناميات الزمنية لأي جين باستخدام التنميط التعبيري. يعد تصميم الظروف التجريبية الصحيحة والنقاط الزمنية أمرا مهما لرسم خرائط الاستجابات البيولوجية لأي حافز بشكل صحيح.
حددت هذه التقنية تفاعلات غير معروفة سابقا بين شراكتين متميزتين لمضيف النبوءة. نظرا لأن معظم البكتيريا تحتوي على نبوءات غير مدروسة ، فإن هذا النهج يمكن أن يساعد في اكتشاف العديد من الأهداف أو التطبيقات العلاجية الجديدة.
