Os prófagos são fagos bacterianos, que se integraram em genomas bacterianos. Estamos usando uma abordagem transcriptômica para explorar de forma abrangente o impacto dos prófagos na biologia de seus hospedeiros bacterianos. Os métodos aqui descritos abordam o desafio chave da indução espontânea do ciclo lítico do prófago.
A otimização cuidadosa das condições de cultura permite um perfil limpo da expressão gênica durante o estado de prófago. Os prófagos são encontrados na maioria dos patógenos bacterianos, mas o significado geralmente não é compreendido. Essas ferramentas podem iluminar o papel dos prófagos como reguladores de múltiplas funções bacterianas.
Existem relações quase ilimitadas entre os prófagos hospedeiros que permanecem não estudadas. Isso representa um enorme recurso inexplorado de potenciais alvos terapêuticos que esses protocolos podem ajudar a prever. O principal desafio é encontrar a condição de cultura adequada para equilibrar o crescimento lisogênico e a indução espontânea de prófagos.
O conhecido desafio secundário, lyson, manter a integridade do RNA para estudos a jusante. Para começar, estabeleça culturas de lisogênio fresco e hospedeiro indicador, inoculando as culturas noturnas em 100 mililitros de LB na proporção de um para 100. Incubar a 37 graus Celsius com agitação a 180 RPM.
Para monitorar o crescimento lisogênico, colete uma amostra de um mililitro a cada hora a partir do ponto de inoculação por oito horas. Em série, diluir a cultura adicionando 100 microlitros em 900 microlitros do meio LV. Vórtice à velocidade máxima e continue a série de diluição de 10 a menos um a 10 a menos nove.
Coloque 10 microlitros da diluição necessária em uma placa de trado LB. Deixe secar e incubar a 30 graus Celsius por 18 a 24 horas. Após a incubação, conte o número de colônias e calcule o número de células bacterianas viáveis usando a fórmula dada.
Em seguida, para enumerar as partículas de fagos infectantes na amostra temporal, adicione 100 microlitros de células hospedeiras indicadoras resistentes à rifampicina em fase logarítmica ao trado superior fundido, juntamente com a rifampicina. Identificar 10 microlitros de cultura lisógena diluída em série na camada de trado superior inoculada. Deixe secar e incube a 37 graus Celsius por 18 a 24 horas.
Após a incubação, conte o número de placas e calcule as partículas infectantes de fagos usando a fórmula dada. Rotular o primeiro frasco como não induzido e os outros como induzidos, juntamente com os momentos em que cada amostra deve ser colhida. Em seguida, subcultivar as culturas lisogênicas cultivadas durante a noite em 80 mililitros de LB na proporção de um para 100 em oito frascos de 250 mililitros.
Incubar os frascos a 37 graus Celsius com agitação a 180 RPM. Após 90 minutos, quando a densidade óptica a 600 nanômetros estiver entre 0,1 e 0,2, adicionar quatro microlitros de ácido acético glacial a 1% ao balão não induzido. Adicionar a cultura de 80 mililitros do frasco não induzido a 720 mililitros de LB e adicionar imediatamente 160 mililitros de solução stop antes de colocar o frasco no gelo durante 30 minutos para estabilizar os transcritos de ARN.
Em seguida, adicionar norfloxacina na concentração final de um micrograma por mililitro ao frasco induzido marcado contendo 80 mililitros de cultura. Misture bem e incube a 37 graus Celsius com agitação a 180 RPM por uma hora. Permitir que as células se recuperem adicionando 80 mililitros de cultura induzida a 720 mililitros de LB. Colher as células bacterianas de cada frasco de 10 em 10 minutos, de zero a uma hora, adicionando uma solução de paragem.
Centrifugar a 10.000 G durante 15 minutos a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante. Antes de ressuspender suavemente o pellet no líquido residual usando a pipeta automática ajustável. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrífuga a 13.000 G por um minuto a quatro graus Celsius.
Descarte o sobrenadante residual e sele o tubo de microfuga, antes de congelar rapidamente os pellets em nitrogênio líquido. Adicione um mililitro de Trizol a cada pellet congelado e homogeneize a suspensão por pipetagem. Após identificar um conjunto de genes-alvo que podem atuar como marcadores para cada estágio de replicação do fago de interesse, amplificar cada um dos genes-alvo do DNA genômico usando primers relevantes.
Realizar PCR utilizando as condições de amplificação descritas no texto manuscrito. Após a PCR, usando um kit de purificação de PCR, purifice cada amplicon e clone-os em um vetor de clonagem de TA de acordo com as instruções do fabricante. Verifique a sequência de cada produto clonado por sequenciamento Sanger.
Depois de calcular o número de cópias de quatro plasmídeos individuais, prepare um modelo padrão para cada gene marcador, diluindo em série o DNA plasmidial em água livre de nucleases. Adicione um microlitro de CDNA e respectivos padrões de plasmídio para cada alvo em uma placa de 96 poços. E realizar PCR quantitativo de acordo com as instruções do fabricante.
Após a PCR, use o programa Excel para plotar o número de cópias de DNA em log versus o limite do ciclo. Execute um cálculo de regressão linear para exibir o coeficiente de determinação e uma equação linear. Em seguida, estime o número de cópias para cada destino usando a equação linear derivada da regressão linear.
Em seguida, calcule a eficácia da amplificação da PCR usando os parâmetros da regressão linear da curva padrão e da equação dada. Depois de validar os primers em termos de sua eficiência percentual, calcule o número absoluto de cópias do DNA. A enumeração temporal da menor produção espontânea de prófagos sugeriu os menores números de UFP por célula em duas horas e os maiores números de UFP por célula em seis horas.
O lisogênio foi então mais estável em duas horas. Então, essa condição foi usada para o perfil do QRTPCR. Um aumento acentuado na expressão do gene cro, um marcador precoce de replicação lítica de 2,31 vezes 10 para a nona cópia em culturas não induzidas para 3,02 vezes 10 para a 11ª cópias 30 minutos após a indução foi observado.
Da mesma forma, as proteínas P e O, o marcador de estágio médio da replicação lítica, também mostraram aumento significativo de 1,74 vezes 10 para a oitava para 1,25 vezes 10 para a 10ª cópias, e de 6,05 vezes 10 para a segunda para 5,68 vezes 10 para a quinta cópias, respectivamente. O marcador tardio do ciclo de replicação lítica mostrou um aumento considerável na expressão em culturas não induzidas até 30 minutos após a indução. Entre os controles internos testados, o RPOD teve a expressão mais estável em comparação com 16 genes SRNA ou ProC.
Em comparação com os marcadores de replicação lítica, a expressão do gene C-one foi relativamente estável. Ainda assim, o número de cópias do gene C-one foi reconfortantemente alto nas culturas não induzidas, em comparação com os marcadores de replicação lítica. Nenhum bom dado ou interpretação pode vir de uma biblioteca de RNA mal preparada.
O controle da indução espontânea e da integridade do RNA são as coisas mais importantes. A dinâmica temporal de qualquer gene pode ser estudada usando o perfil de expressão. Adequar as condições experimentais e os pontos de tempo corretos é importante para mapear corretamente as respostas biológicas a qualquer estímulo.
Esta técnica identificou interações até então desconhecidas entre duas parcerias distintas de prófagos. Uma vez que a maioria das bactérias abriga prófagos não estudados, esta abordagem poderia ajudar a descobrir muitos novos alvos terapêuticos ou aplicações.
