Prophagen sind bakterielle Phagen, die sich in bakterielle Genome integriert haben. Wir verwenden einen transkriptomischen Ansatz, um den Einfluss von Prophagen auf die Biologie ihrer bakteriellen Wirte umfassend zu untersuchen. Die hier beschriebenen Methoden adressieren die zentrale Herausforderung der spontanen Induktion des lytischen Prophagenzyklus.
Eine sorgfältige Optimierung der Kulturbedingungen ermöglicht ein sauberes Profiling der Genexpression während des Prophagenstadiums. Prophagen kommen in den meisten bakteriellen Krankheitserregern vor, aber die Bedeutung wird in der Regel nicht verstanden. Diese Werkzeuge können die Rolle von Prophagen als Regulatoren mehrerer bakterieller Funktionen beleuchten.
Es gibt nahezu unbegrenzte Wirtsbeziehungen zwischen den Prophagen, die noch unerforscht sind. Dies stellt eine riesige ungenutzte Ressource potenzieller therapeutischer Ziele dar, bei deren Vorhersage diese Protokolle helfen können. Die größte Herausforderung besteht darin, die richtigen Kulturbedingungen zu finden, um das Lysogenwachstum und die spontane Prophageninduktion in Einklang zu bringen.
Die bekannte sekundäre Herausforderung, Lyson, ist die Aufrechterhaltung der RNA-Integrität für nachgelagerte Studien. Um zu beginnen, richten Sie frische Lysogen- und Indikatorwirtskulturen ein, indem Sie die Übernachtkulturen in 100 Millilitern LB in einem Verhältnis von eins zu 100 inokulieren. Inkubieren bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 180 U/min.
Um das Lysogenwachstum zu überwachen, entnehmen Sie acht Stunden lang stündlich eine Probe von einem Milliliter ab dem Zeitpunkt der Impfung. Verdünnen Sie die Kultur seriell durch Zugabe von 100 Mikrolitern in 900 Mikroliter des LV-Mediums. Wirbeln Sie mit maximaler Geschwindigkeit und setzen Sie die Verdünnungsreihe von 10 bis minus eins bis 10 bis minus neun fort.
Geben Sie 10 Mikroliter der erforderlichen Verdünnung auf eine LB-Schneckenplatte. Trocknen lassen und 18 bis 24 Stunden bei 30 Grad Celsius inkubieren. Zählen Sie nach der Inkubation die Anzahl der Kolonien und berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterienzellen mit der angegebenen Formel.
Um dann die infektiösen Phagenpartikel in der temporalen Probe zu zählen, werden 100 Mikroliter Rifampicin-resistente Indikatorwirtszellen der Log-Phase zusammen mit Rifampicin in die geschmolzene obere Schnecke gegeben. 10 Mikroliter seriell verdünnte Lysogenkultur auf die inokulierte obere Schneckenschicht geben. Trocknen lassen und 18 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Zählen Sie nach der Inkubation die Anzahl der Plaques und berechnen Sie die infektiösen Phagenpartikel anhand der angegebenen Formel. Kennzeichnen Sie den ersten Kolben als nicht induziert und die anderen als induziert, zusammen mit den Zeitpunkten, zu denen jede Probe geerntet werden sollte. Dann werden die über Nacht gezüchteten lysogenen Kulturen in 80 Milliliter LB in einem Verhältnis von eins zu 100 in acht 250-Milliliter-Kolben subkultiviert.
Die Kolben werden bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 180 U/min inkubiert. Nach 90 Minuten, wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern zwischen 0,1 und 0,2 liegt, werden vier Mikroliter 1%iger Eisessig in den nicht induzierten Kolben gegeben. Die 80-Milliliter-Kultur aus dem nicht induzierten Kolben wird zu 720 Millilitern LB gegeben und sofort 160 Milliliter Stopplösung hinzugefügt, bevor der Kolben 30 Minuten lang auf Eis gelegt wird, um die RNA-Transkripte zu stabilisieren.
Als nächstes wird Norfloxacin in einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter in den induzierten markierten Kolben gegeben, der 80 Milliliter Kultur enthält. Gut mischen und bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 180 U/min eine Stunde lang inkubieren. Lassen Sie die Zellen sich erholen, indem Sie 80 Milliliter induzierte Kultur zu 720 Millilitern LB hinzufügen. Entnehmen Sie die Bakterienzellen aus jedem Kolben alle 10 Minuten von null bis zu einer Stunde, indem Sie eine Stopplösung hinzufügen.
Bei 10.000 g 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Vor dem vorsichtigen Resuspendieren des Pellets in der Restflüssigkeit mit der einstellbaren automatischen Pipette. Die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 13.000 g für eine Minute bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Entsorgen Sie den Restüberstand und versiegeln Sie das Mikrofugenröhrchen, bevor Sie die Pellets zu flüssigem Stickstoff schockgefrieren. Geben Sie einen Milliliter Trizol in jedes gefrorene Pellet und homogenisieren Sie die Suspension durch Pipettieren. Nachdem Sie eine Reihe von Zielgenen identifiziert haben, die als Marker für jedes Stadium der Replikation des interessierenden Phagen fungieren können, amplifizieren Sie jedes der Zielgene aus der genomischen DNA unter Verwendung relevanter Primer.
Führen Sie die PCR unter den im Textmanuskript beschriebenen Amplifikationsbedingungen durch. Nach der PCR wird jedes Amplikon mit einem PCR-Aufreinigungskit gereinigt und gemäß den Anweisungen des Herstellers in einen TA-Klonierungsvektor gekloniert. Überprüfen Sie die Reihenfolge jedes geklonten Produkts durch Sanger-Sequenzierung.
Nachdem Sie die Kopienzahl von vier einzelnen Plasmiden berechnet haben, bereiten Sie eine Standardvorlage für jedes Markergen vor, indem Sie die Plasmid-DNA seriell in nukleasefreiem Wasser verdünnen. Fügen Sie einen Mikroliter CDNA und die entsprechenden Plasmidstandards für jedes Ziel in eine 96-Well-Platte hinzu. Und führen Sie eine quantitative PCR gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
Verwenden Sie nach der PCR das Excel-Programm, um die logarithmische DNA-Kopienzahl im Vergleich zum Zyklusschwellenwert darzustellen. Führen Sie eine lineare Regressionsberechnung durch, um das Bestimmtheitsmaß und eine lineare Gleichung anzuzeigen. Schätzen Sie als Nächstes die Kopienzahl für jedes Ziel mithilfe der linearen Gleichung, die aus der linearen Regression abgeleitet wurde.
Berechnen Sie dann die Wirksamkeit der PCR-Amplifikation anhand der Parameter aus der linearen Regression der Standardkurve und der gegebenen Gleichung. Nachdem Sie die Primer hinsichtlich ihrer prozentualen Effizienz validiert haben, berechnen Sie die absolute Kopienzahl der DNA. Die zeitliche Zählung der spontanen Produktion von weniger Prophagen ergab die niedrigsten PFU-Zahlen pro Zelle nach zwei Stunden und die höchsten PFU-Zahlen pro Zelle nach sechs Stunden.
Das Lysogen war dann nach zwei Stunden am stabilsten. Daher wurde diese Bedingung für die QRTPCR-Profilerstellung verwendet. Es wurde ein deutlicher Anstieg der Expression des cro-Gens, eines frühen Markers der lytischen Replikation, von 2,31 mal 10 bis zur neunten Kopie in nicht induzierten Kulturen auf 3,02 mal 10 bis 11 Kopien 30 Minuten nach der Induktion beobachtet.
In ähnlicher Weise zeigten auch P- und O-Proteine, der Marker im mittleren Stadium der lytischen Replikation, eine signifikante Hochregulierung von 1,74 mal 10 auf die achte auf 1,25 mal 10 auf die 10. Kopie und von 6,05 mal 10 auf die Sekunde auf 5,68 mal 10 auf die fünfte Kopie. Der späte Marker des lytischen Replikationszyklus zeigte bis 30 Minuten nach der Induktion einen deutlichen Anstieg der Expression in nicht induzierten Kulturen. Unter den getesteten internen Kontrollen wies RPOD die stabilste Expression im Vergleich zu 16 SRNA- oder ProC-Genen auf.
Im Vergleich zu den Markern für die lytische Replikation war die Expression des C-one-Gens relativ stabil. Dennoch war die Kopienzahl des C-one-Gens in den nicht induzierten Kulturen im Vergleich zu den Markern für die lytische Replikation beruhigend hoch. Aus einer schlecht vorbereiteten RNA-Bibliothek können keine guten Daten oder Interpretationen gewonnen werden.
Die Kontrolle der spontanen Induktion und der RNA-Integrität sind die wichtigsten Dinge. Die zeitliche Dynamik eines beliebigen Gens kann mit Hilfe von Expressionsprofilen untersucht werden. Die Anpassung der richtigen Versuchsbedingungen und Zeitpunkte ist wichtig, um biologische Reaktionen auf jeden Stimulus korrekt abzubilden.
Mit dieser Technik wurden bisher unbekannte Wechselwirkungen zwischen zwei unterschiedlichen Prophagen-Wirtspartnerschaften identifiziert. Da die meisten Bakterien unerforschte Prophagen beherbergen, könnte dieser Ansatz dazu beitragen, viele neue therapeutische Ziele oder Anwendungen zu entdecken.
