Les prophages sont des phages bactériens, qui se sont intégrés dans les génomes bactériens. Nous utilisons une approche transcriptomique pour explorer de manière exhaustive l’impact des prophages sur la biologie de leurs hôtes bactériens. Les méthodes décrites ici répondent au défi clé de l’induction spontanée du cycle lytique des prophages.
Une optimisation minutieuse des conditions de culture permet un profilage propre de l’expression des gènes pendant l’état de prophage. Les prophages se trouvent dans la plupart des agents pathogènes bactériens, mais leur signification n’est généralement pas comprise. Ces outils peuvent mettre en lumière le rôle des prophages en tant que régulateurs de multiples fonctions bactériennes.
Il existe des relations entre les prophages et les hôtes presque illimitées qui ne sont pas étudiées. Il s’agit d’une énorme ressource inexploitée de cibles thérapeutiques potentielles que ces protocoles peuvent aider à prévoir. Le principal défi consiste à trouver les bonnes conditions de culture pour équilibrer la croissance du lysogène et l’induction spontanée du prophage.
Le défi secondaire bien connu, le lyson, maintient l’intégrité de l’ARN pour les études en aval. Pour commencer, mettre en place des cultures hôtes de lysogène et d’indicateur frais en inoculant les cultures de nuit dans 100 millilitres de LB dans un rapport de un à 100. Incuber à 37 degrés Celsius avec agitation à 180 tr/min.
Pour surveiller la croissance des lysogènes, prélever un échantillon d’un millilitre toutes les heures à partir du point d’inoculation pendant huit heures. En série, diluer la culture en ajoutant 100 microlitres dans 900 microlitres de milieu VG. Vortex à la vitesse maximale, et continuer la série de dilution de 10 à moins un à 10 à moins neuf.
Repérez 10 microlitres de la dilution requise sur une plaque de vis sans fin LB. Laisser sécher et incuber à 30 degrés Celsius pendant 18 à 24 heures. Après incubation, comptez le nombre de colonies et calculez le nombre de cellules bactériennes viables à l’aide de la formule donnée.
Ensuite, pour dénombrer les particules de phages infectieuses dans l’échantillon temporal, ajoutez 100 microlitres de cellules hôtes indicatrices résistantes à la rifampicine en phase logarithmique à la vis supérieure fondue, ainsi que de la rifampicine. Appliquez 10 microlitres de culture de lysogène diluée en série sur la couche supérieure de la vis sans fin inoculée. Laisser sécher et incuber à 37 degrés Celsius pendant 18 à 24 heures.
Après incubation, comptez le nombre de plaques et calculez les particules de phages infectieuses à l’aide de la formule donnée. Étiquetez la première fiole comme non induite et les autres comme induites, ainsi que les moments où chaque échantillon doit être prélevé. Ensuite, sous-culture des cultures lysogéniques cultivées pendant la nuit dans 80 millilitres de LB à un rapport de un à 100 dans huit flacons de 250 millilitres.
Incuber les flacons à 37 degrés Celsius en agitant à 180 tr/min. Après 90 minutes, lorsque la densité optique à 600 nanomètres est comprise entre 0,1 et 0,2, ajoutez quatre microlitres d’acide acétique glacial à 1 % dans la fiole non induite. Ajouter la culture de 80 millilitres de la fiole non induite à 720 millilitres de LB et ajouter immédiatement 160 millilitres de solution d’arrêt avant de placer la fiole sur de la glace pendant 30 minutes pour stabiliser les transcrits d’ARN.
Ensuite, ajoutez de la norfloxacine à une concentration finale d’un microgramme par millilitre dans la fiole marquée induite contenant 80 millilitres de culture. Bien mélanger et incuber à 37 degrés Celsius en agitant à 180 tr/min pendant une heure. Permettre aux cellules de récupérer en ajoutant 80 millilitres de culture induite à 720 millilitres de LB. Prélever les cellules bactériennes de chaque flacon toutes les 10 minutes de zéro à une heure en ajoutant une solution d’arrêt.
Centrifuger à 10 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant. Avant de remettre délicatement la pastille en suspension dans le liquide résiduel à l’aide de la pipette automatique réglable. Transférez la suspension dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre et centrifugez à 13 000 G pendant une minute à quatre degrés Celsius.
Jetez le surnageant résiduel et scellez le tube de la microfuge, avant de congeler les pastilles en azote liquide. Ajoutez un millilitre de Trizol à chaque pastille congelée et homogénéisez la suspension par pipetage. Après avoir identifié un ensemble de gènes cibles qui peuvent servir de marqueurs pour chaque étape de la réplication du phage d’intérêt, amplifiez chacun des gènes cibles à partir de l’ADN génomique à l’aide d’amorces appropriées.
Effectuer la PCR en utilisant les conditions d’amplification décrites dans le manuscrit du texte. Après PCR, à l’aide d’un kit de purification PCR, purifiez chaque amplicon et clonez-les dans un vecteur de clonage TA selon les instructions du fabricant. Vérifier la séquence de chaque produit cloné par séquençage de Sanger.
Après avoir calculé le nombre de copies de quatre plasmides individuels, préparez un modèle standard pour chaque gène marqueur en diluant en série l’ADN plasmidique dans de l’eau exempte de nucléase. Ajoutez un microlitre de CDNA et les étalons plasmidiques respectifs pour chaque cible dans une plaque à 96 puits. Et effectuez une PCR quantitative selon les instructions du fabricant.
Après la PCR, utilisez le programme Excel pour tracer le nombre de copies d’ADN logarithmique par rapport au seuil de cycle. Effectuez un calcul de régression linéaire pour afficher le coefficient de détermination et une équation linéaire. Ensuite, estimez le nombre de copies pour chaque cible à l’aide de l’équation linéaire dérivée de la régression linéaire.
Calculez ensuite l’efficacité de l’amplification PCR à l’aide des paramètres de la régression linéaire de la courbe standard et de l’équation donnée. Après avoir validé les amorces en termes de pourcentage d’efficacité, calculez le nombre absolu de copies de l’ADN. Le dénombrement temporel de la production spontanée de moins de prophages a suggéré le nombre de PFU le plus bas par cellule à deux heures et le nombre le plus élevé de PFU par cellule à six heures.
Le lysogène était alors le plus stable à deux heures. Cette condition a donc été utilisée pour le profilage QRTPCR. Une augmentation marquée de l’expression du gène cro, un marqueur précoce de la réplication lytique de 2,31 fois 10 à la neuvième copie dans les cultures non induites à 3,02 fois 10 à la 11e copie 30 minutes après l’induction a été observée.
De même, les protéines P et O, le marqueur de la réplication lytique au stade intermédiaire, ont également montré une régulation positive significative de 1,74 fois 10 à la huitième à 1,25 fois 10 à la 10e copie, et de 6,05 fois 10 à la deuxième à 5,68 fois 10 à la cinquième copie respectivement. Le marqueur tardif du cycle de réplication lytique a montré une augmentation considérable de l’expression dans les cultures non induites jusqu’à 30 minutes après l’induction. Parmi les contrôles internes testés, le RPOD avait l’expression la plus stable par rapport aux 16 gènes SRNA ou ProC.
Par rapport aux marqueurs de la réplication lytique, l’expression du gène C-one était relativement stable. Pourtant, le nombre de copies du gène C-one était rassurant dans les cultures non induites, par rapport aux marqueurs de la réplication lytique. Aucune bonne donnée ou interprétation ne peut provenir d’une banque d’ARN mal préparée.
Le contrôle de l’induction spontanée et de l’intégrité de l’ARN sont les choses les plus importantes. La dynamique temporelle de n’importe quel gène peut être étudiée à l’aide du profilage d’expression. Il est important d’adapter les conditions expérimentales et les moments appropriés pour cartographier correctement les réponses biologiques à tout stimulus.
Cette technique a permis d’identifier des interactions jusqu’alors inconnues entre deux partenariats distincts entre les prophages hôtes. Étant donné que la plupart des bactéries abritent des prophages non étudiés, cette approche pourrait aider à découvrir de nombreuses nouvelles cibles ou applications thérapeutiques.
