Профаги – это бактериальные фаги, которые интегрировались в бактериальные геномы. Мы используем транскриптомный подход для всестороннего изучения влияния профагов на биологию их бактериальных хозяев. Методы, описанные здесь, решают ключевую проблему спонтанной индукции литического цикла профагов.
Тщательная оптимизация условий культивирования позволяет четко профилировать экспрессию генов в состоянии профага. Профаги обнаружены в большинстве бактериальных патогенов, но их значение обычно не понятно. Эти инструменты могут пролить свет на роль профагов как регуляторов многих бактериальных функций.
Существует почти безграничное количество взаимоотношений между хозяевами-профагами, которые остаются неизученными. Это представляет собой огромный неиспользованный ресурс потенциальных терапевтических мишеней, которые эти протоколы могут помочь предсказать. Основная проблема заключается в том, чтобы найти правильные условия для культивирования, чтобы сбалансировать рост лизогена и спонтанную индукцию профага.
Хорошо известная вторичная задача, лисон, поддержание целостности РНК для последующих исследований. Для начала установите свежие лизогенные и индикаторные культуры-хозяева, инокулировав ночные культуры в 100 миллилитров LB в соотношении один к 100. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия при встряхивании при 180 оборотах в минуту.
Чтобы контролировать рост лизогена, собирайте образец размером один миллилитр каждый час от места инокуляции в течение восьми часов. Последовательно разбавляют культуру, добавляя 100 микролитров в 900 микролитров среды ЛЖ. Вихрь на максимальной скорости, и продолжайте серию разбавления от 10 до минус одного до 10 до минус девяти.
Нанесите 10 микролитров необходимого разбавления на пластину шнека LB. Дайте высохнуть и выдержите при температуре 30 градусов Цельсия от 18 до 24 часов. После инкубации подсчитайте количество колоний и рассчитайте количество жизнеспособных бактериальных клеток по заданной формуле.
Затем, чтобы перечислить инфекционные фаговые частицы во временном образце, добавьте 100 микролитров логарифмически фазовых рифампицин-резистентных клеток-хозяев в расплавленный верхний шнек вместе с рифампицином. Поместите 10 микролитров последовательно разведенной культуры лизогена на инокулированный верхний слой шнека. Дают высохнуть и выдерживают при температуре 37 градусов Цельсия от 18 до 24 часов.
После инкубации подсчитайте количество бляшек и рассчитайте инфекционные фаговые частицы по приведенной формуле. Пометьте первую колбу как неиндуцированную, а остальные как индуцированные, а также укажите моменты времени, когда должна быть взята каждая проба. Затем субкультивируют выращенные за ночь лизогенные культуры в 80 миллилитрах LB в соотношении один к 100 в восьми колбах по 250 миллилитров.
Инкубируйте колбы при температуре 37 градусов Цельсия при встряхивании при 180 об/мин. Через 90 минут, когда оптическая плотность на длине волны составляет от 0,1 до 0,2, добавьте четыре микролитра 1%-ной ледяной уксусной кислоты в неиндуцированную колбу. Добавьте 80-миллилитровую культуру из неиндуцированной колбы в 720 миллилитров LB и сразу же добавьте 160 миллилитров стоп-раствора, прежде чем поместить колбу на лед на 30 минут для стабилизации транскриптов РНК.
Затем добавляют норфлоксацин в конечной концентрации один микрограмм на миллилитр в индуцированную меченую колбу, содержащую 80 миллилитров культуры. Хорошо перемешать и инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия при встряхивании при 180 об/мин в течение одного часа. Дайте клеткам восстановиться, добавив 80 миллилитров индуцированной культуры к 720 миллилитрам LB. Собирайте бактериальные клетки из каждой колбы каждые 10 минут с нуля до одного часа, добавляя стоп-раствор.
Центрифугу при 10 000 G в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Перед тем, как аккуратно повторно суспендировать гранулу в остаточной жидкости с помощью регулируемой автоматической пипетки. Перелейте суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугу при давлении 13 000 G в течение одной минуты при температуре четыре градуса Цельсия.
Выбросьте остаточную надосадочную жидкость и запечатайте пробирку микрофуги, прежде чем мгновенно заморозить гранулы в жидкий азот. Добавьте один миллилитр Тризола к каждой замороженной грануле и гомогенизируйте суспензию путем пипетирования. После определения набора генов-мишеней, которые могут выступать в качестве маркеров для каждой стадии репликации интересующего фага, амплифицируют каждый из генов-мишеней из геномной ДНК с помощью соответствующих праймеров.
Выполняйте ПЦР с использованием условий амплификации, описанных в текстовой рукописи. После ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР очистите каждый ампликон и клонируйте их в вектор клонирования ТА в соответствии с инструкциями производителя. Проверка последовательности каждого клонированного продукта с помощью секвенирования по Сэнгеру.
После вычисления числа копий четырех отдельных плазмид подготовьте стандартный шаблон для каждого гена-маркера, последовательно разбавляя плазмидную ДНК в безнуклеазной воде. Добавьте один микролитр CDNA и соответствующие стандарты плазмид для каждой мишени в 96-луночный планшет. И выполнить количественную ПЦР в соответствии с инструкцией производителя.
После ПЦР используйте программу Excel, чтобы построить график зависимости количества копий ДНК от порогового значения цикла. Выполните расчет линейной регрессии, чтобы отобразить коэффициент детерминации и линейное уравнение. Затем оцените количество копий для каждой цели, используя линейное уравнение, полученное из линейной регрессии.
Затем рассчитайте эффективность амплификации ПЦР, используя параметры из линейной регрессии стандартной кривой и заданного уравнения. После проверки праймеров с точки зрения их процентной эффективности рассчитайте абсолютное число копий ДНК. Временная перепись спонтанного меньшего количества профагов показала самые низкие значения ПФУ на клетку через два часа и самые высокие числа ПФУ на клетку через шесть часов.
Лизоген был наиболее стабилен в течение двух часов. Таким образом, это условие было использовано для профилирования QRTPCR. Наблюдалось заметное увеличение экспрессии гена cro, раннего маркера литической репликации, с 2,31 раза по 10 до 9 копий в неиндуцированных культурах до 3,02 раз по 10 до 11 копий через 30 минут после индукции.
Аналогичным образом, белки P и O, маркер средней стадии литической репликации, также показали значительное повышение регуляции от 1,74 умножить на 10 до восьмой до 1,25 умножить на 10 до 10-й копии и с 6,05 умножить на 10 ко второй до 5,68 умножить на 10 до пятой копии соответственно. Поздний маркер цикла литической репликации показал значительное увеличение экспрессии в неиндуцированных культурах до 30 минут после индукции. Среди протестированных внутренних контрольных групп RPOD имел наиболее стабильную экспрессию по сравнению с 16 генами SRNA или ProC.
По сравнению с маркерами литической репликации, экспрессия гена C-one была относительно стабильной. Тем не менее, число копий гена C-one было обнадеживающе высоким в неиндуцированных культурах по сравнению с маркерами литической репликации. Никакие хорошие данные или интерпретации не могут быть получены из плохо подготовленной библиотеки РНК.
Контроль спонтанной индукции и целостности РНК являются наиболее важными вещами. Временная динамика любого гена может быть изучена с помощью профилирования экспрессии. Адаптация правильных экспериментальных условий и временных точек важна для правильного картирования биологических реакций на любой стимул.
Этот метод выявил ранее неизвестные взаимодействия между двумя различными партнерствами хозяев-профагов. Поскольку большинство бактерий содержат неизученные профаги, этот подход может помочь открыть много новых терапевтических мишеней или применений.
