Los profagos son fagos bacterianos que se han integrado en los genomas bacterianos. Estamos utilizando un enfoque transcriptómico para explorar exhaustivamente el impacto de los profagos en la biología de sus huéspedes bacterianos. Los métodos aquí descritos abordan el desafío clave de la inducción espontánea del ciclo lítico del profago.
La optimización cuidadosa de las condiciones de cultivo permite un perfil limpio de la expresión génica durante el estado de profago. Los profagos se encuentran en la mayoría de los patógenos bacterianos, pero generalmente no se comprende su significado. Estas herramientas pueden iluminar el papel de los profagos como reguladores de múltiples funciones bacterianas.
Hay relaciones casi ilimitadas entre profagos y hospedadores que permanecen sin estudiar. Esto representa un enorme recurso sin explotar de posibles dianas terapéuticas que estos protocolos pueden ayudar a predecir. El principal desafío es encontrar las condiciones de cultivo adecuadas para equilibrar el crecimiento de lisógeno y la inducción espontánea de profagos.
El conocido reto secundario, el lisón, mantiene la integridad del ARN para estudios posteriores. Para comenzar, configure cultivos frescos de lisógeno y hospedador indicador inoculando los cultivos durante la noche en 100 mililitros de LB en una proporción de uno a 100. Incubar a 37 grados centígrados con agitación a 180 RPM.
Para controlar el crecimiento del lisógeno, recoja una muestra de un mililitro cada hora desde el punto de inoculación durante ocho horas. En serie, diluya el cultivo añadiendo 100 microlitros en 900 microlitros del medio LV. Vórtice a la velocidad máxima y continúe la serie de dilución de 10 a menos uno a 10 a menos nueve.
Coloque 10 microlitros de la dilución requerida en una placa de barrena LB. Dejar secar e incubar a 30 grados centígrados durante 18 a 24 horas. Después de la incubación, cuente el número de colonias y calcule el número de células bacterianas viables utilizando la fórmula dada.
A continuación, para enumerar las partículas de fagos infecciosos en la muestra temporal, agregue 100 microlitros de células huésped indicadoras resistentes a la rifampicina en fase logarítmica a la barrena superior fundida, junto con rifampicina. Coloque 10 microlitros de cultivo de lisógeno diluido en serie en la capa superior del sinfín inoculada. Se deja secar, e incubar a 37 grados centígrados durante 18 a 24 horas.
Después de la incubación, cuente el número de placas y calcule las partículas de fagos infecciosos utilizando la fórmula dada. Etiquete el primer matraz como no inducido y los demás como inducidos, junto con los puntos de tiempo en los que se debe recolectar cada muestra. A continuación, subcultive los cultivos lisogénicos cultivados durante la noche en 80 mililitros de LB en una proporción de uno a 100 en ocho matraces de 250 mililitros.
Incubar los matraces a 37 grados centígrados agitando a 180 RPM. Después de 90 minutos, cuando la densidad óptica a 600 nanómetros esté entre 0,1 y 0,2, agregue cuatro microlitros de ácido acético glacial al 1% al matraz no inducido. Agregue el cultivo de 80 mililitros del matraz no inducido a 720 mililitros de LB e inmediatamente agregue 160 mililitros de solución de parada antes de colocar el matraz en hielo durante 30 minutos para estabilizar las transcripciones de ARN.
A continuación, agregue norfloxacino a una concentración final de un microgramo por mililitro al matraz etiquetado inducido que contiene 80 mililitros de cultivo. Mezclar bien e incubar a 37 grados centígrados agitando a 180 RPM durante una hora. Permita que las células se recuperen agregando 80 mililitros de cultivo inducido a 720 mililitros de LB. Recoja las células bacterianas de cada matraz cada 10 minutos de cero a una hora agregando una solución de parada.
Centrifugar a 10.000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Antes de volver a suspender suavemente el pellet en el líquido residual utilizando la pipeta automática ajustable. Transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue a 13, 000 G durante un minuto a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante residual y selle el tubo de microfuga, antes de congelar rápidamente los gránulos en nitrógeno líquido. Agregue un mililitro de Trizol a cada gránulo congelado y homogeneice la suspensión mediante pipeteo. Después de identificar un conjunto de genes diana que puedan actuar como marcadores para cada etapa de replicación del fago de interés, amplifique cada uno de los genes diana del ADN genómico utilizando los cebadores pertinentes.
Realizar PCR utilizando las condiciones de amplificación descritas en el manuscrito de texto. Después de la PCR, utilizando un kit de purificación de PCR, purifique cada amplicón y clónelos en un vector de clonación de TA según las instrucciones del fabricante. Verifique la secuencia de cada producto clonado mediante secuenciación de Sanger.
Después de calcular el número de copias de cuatro plásmidos individuales, prepare una plantilla estándar para cada gen marcador diluyendo en serie el ADN del plásmido en agua libre de nucleasas. Agregue un microlitro de CDNA y los patrones de plásmido respectivos para cada objetivo en una placa de 96 pocillos. Y realizar PCR cuantitativa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Después de la PCR, utilice el programa Excel para trazar el número de copias de ADN logarítmico frente al umbral del ciclo. Realice un cálculo de regresión lineal para mostrar el coeficiente de determinación y una ecuación lineal. A continuación, estime el número de copias para cada objetivo utilizando la ecuación lineal derivada de la regresión lineal.
A continuación, calcule la eficacia de la amplificación por PCR utilizando los parámetros de la regresión lineal de la curva estándar y la ecuación dada. Después de validar los cebadores en términos de su eficiencia porcentual, calcule el número absoluto de copias del ADN. La enumeración temporal de la producción espontánea de menos profagos sugirió el número más bajo de PFU por célula a las dos horas y el número más alto de PFU por célula a las seis horas.
El lisógeno se mantuvo más estable a las dos horas. Por lo tanto, esta condición se utilizó para la elaboración de perfiles QRTPCR. Se observó un marcado aumento en la expresión del gen cro, un marcador temprano de replicación lítica de 2,31 veces 10 a la novena copia en cultivos no inducidos a 3,02 veces 10 a la undécima copia 30 minutos después de la inducción.
De manera similar, las proteínas P y O, el marcador de la etapa intermedia de la replicación lítica, también mostraron una regulación positiva significativa de 1,74 veces 10 a la octava a 1,25 veces 10 a la décima copia, y de 6,05 veces 10 a la segunda a 5,68 veces 10 a la quinta copia, respectivamente. El marcador tardío del ciclo de replicación lítica mostró un aumento considerable en la expresión en cultivos no inducidos a los 30 minutos después de la inducción. Entre los controles internos probados, RPOD tuvo la expresión más estable en comparación con 16 genes SRNA o ProC.
En comparación con los marcadores de replicación lítica, la expresión del gen C-ona fue relativamente estable. Aun así, el número de copias del gen C-ona fue tranquilizadoramente alto en los cultivos no inducidos, en comparación con los marcadores de replicación lítica. Ningún buen dato o interpretación puede provenir de una biblioteca de ARN mal preparada.
El control de la inducción espontánea y la integridad del ARN son las cosas más importantes. La dinámica temporal de cualquier gen puede estudiarse mediante perfiles de expresión. Adaptar las condiciones experimentales y los puntos de tiempo correctos es importante para mapear correctamente las respuestas biológicas a cualquier estímulo.
Esta técnica ha identificado interacciones previamente desconocidas entre dos asociaciones distintas de hospedadores profagos. Dado que la mayoría de las bacterias albergan profagos no estudiados, este enfoque podría ayudar a descubrir muchas dianas o aplicaciones terapéuticas novedosas.
