פרופג'ים הם פאגים חיידקיים, שהשתלבו בגנומים של חיידקים. אנו משתמשים בגישת שעתוק כדי לחקור באופן מקיף את ההשפעה של פרופג'ים על הביולוגיה של המארחים החיידקיים שלהם. השיטות המתוארות כאן עוסקות באתגר המרכזי של אינדוקציה ספונטנית של המחזור הליטי פרופאג'י.
אופטימיזציה זהירה של תנאי התרבית מאפשרת אפיון נקי של ביטוי גנים במהלך מצב הפרופאג'. פרופג'ים נמצאים ברוב הפתוגנים החיידקיים, אך בדרך כלל לא מבינים את משמעותם. כלים אלה יכולים להאיר את תפקידם של פרופג'ים כמווסתים של תפקודים חיידקיים מרובים.
ישנם יחסים כמעט בלתי מוגבלים בין מארחי פרופג' שנותרו בלתי נחקרים. זה מייצג משאב עצום ולא מנוצל של מטרות טיפוליות פוטנציאליות שפרוטוקולים אלה יכולים לעזור לחזות. האתגר העיקרי הוא למצוא את תנאי התרבית הנכון כדי לאזן את צמיחת הליזוגן ואת השראת הפרופאגים הספונטנית.
האתגר המשני הידוע, ליסון, שמירה על שלמות הרנ"א למחקרים במורד הזרם. להתחיל להקים תרביות מארחות ליזוגן ואינדיקטור טריות על ידי חיסון תרביות הלילה ב-100 מיליליטר של LB ביחס של אחד עד 100. דוגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-180 סל"ד.
כדי לעקוב אחר צמיחת הליזוגן, יש לאסוף דגימה של מיליליטר בכל שעה מנקודת החיסון למשך שמונה שעות. באופן סדרתי, לדלל את התרבות על ידי הוספת 100 מיקרוליטר לתוך 900 מיקרוליטר של מדיום LV. מערבלים במהירות המרבית, וממשיכים את סדרת הדילול מ-10 למינוס אחד ל-10 למינוס תשע.
נקוב 10 מיקרוליטר של הדילול הנדרש על צלחת אוגר LB. מניחים להתייבש ולדגור ב 30 מעלות צלזיוס במשך 18 עד 24 שעות. לאחר הדגירה, ספרו את מספר המושבות וחשבו את מספר תאי החיידקים בני קיימא באמצעות הנוסחה הנתונה.
לאחר מכן, כדי למנות את חלקיקי הפאגים המזהמים בדגימה הטמפורלית, הוסף 100 מיקרוליטר של תאי אינדיקטור עמידים בפני ריפמפיצין בשלב לוג לאוגר העליון המותך, יחד עם ריפמפיצין. הבחינו ב-10 מיקרוליטרים של תרבית ליזוגן מדוללת סדרתית על שכבת האוגר העליונה המחוסנת. מותר להתייבש, לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 עד 24 שעות.
לאחר הדגירה, ספרו את מספר הפלאק וחשבו את חלקיקי הפאגים המזהמים באמצעות הנוסחה הנתונה. תייגו את הבקבוק הראשון כבלתי מושרה ואת האחרים כמושרה, יחד עם נקודות הזמן שבהן יש לקצור כל דגימה. לאחר מכן תת-תרבית את התרביות הליזוגניות שגדלו בן לילה ב-80 מיליליטר של LB ביחס של אחד עד 100 בשמונה צלוחיות של 250 מיליליטר.
דוגרים על הצלוחיות ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-180 סל"ד. לאחר 90 דקות, כאשר הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר היא בין 0.1 ל-0.2, הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של חומצה אצטית קרחונית 1% לצלוחית הבלתי מושרית. הוסף את תרבית 80 מיליליטר מהבקבוק הלא מושרה ל 720 מיליליטר של LB ומיד הוסף 160 מיליליטר של תמיסת עצירה לפני הנחת הבקבוק על קרח למשך 30 דקות כדי לייצב את תעתיקי ה- RNA.
לאחר מכן, להוסיף norfloxacin בריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר לבקבוק מסומן מושרה המכיל 80 מיליליטר של תרבית. מערבבים היטב ודגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-180 סל"ד למשך שעה. לאפשר לתאים להתאושש על ידי הוספת 80 מיליליטר של תרבית מושרית ל 720 מיליליטר של LB. קצרו את תאי החיידק מכל בקבוק כל 10 דקות מאפס עד שעה על ידי הוספת תמיסת עצירה.
צנטריפוגה ב 10, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. לפני השעיית הגלולה מחדש בעדינות בנוזל השיורי באמצעות פיפטה אוטומטית מתכווננת. העבר את המתלה לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה ב -13, 000 G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס.
יש להשליך את שאריות הסופרנאטנט ולאטום את צינור המיקרופוגה, לפני הקפאת הבזק את הכדוריות לחנקן נוזלי. מוסיפים מיליליטר אחד של טריזול לכל גלולה קפואה, והופכים את התרחיף להומוגני על ידי פיפטינג. לאחר זיהוי קבוצה של גני מטרה שיכולים לשמש כסמנים לכל שלב של שכפול הפאגים המעניינים, הגבירו כל אחד מגני המטרה מהדנ"א הגנומי באמצעות פריימרים רלוונטיים.
ביצוע PCR באמצעות תנאי ההגברה המתוארים בכתב היד של הטקסט. לאחר PCR, באמצעות ערכת טיהור PCR לטהר כל אמפליקון ולשכפל אותם בווקטור שיבוט TA בהתאם להוראות היצרן. אמת את הרצף של כל מוצר משוכפל על ידי ריצוף Sanger.
לאחר חישוב מספר ההעתק של ארבעה פלסמידים בודדים, הכינו תבנית סטנדרטית לכל גן סמן על ידי דילול סדרתי של DNA הפלסמיד במים נטולי נוקלאז. הוסף מיקרוליטר אחד של CDNA ותקני פלסמיד מתאימים לכל מטרה בצלחת באר 96. ולבצע PCR כמותי בהתאם להוראות היצרן.
לאחר PCR, השתמש בתוכנית Excel כדי להתוות את מספר עותק ה- DNA של היומן לעומת סף המחזור. בצע חישוב רגרסיה ליניארית כדי להציג את מקדם הקביעה ומשוואה ליניארית. לאחר מכן, הערך את מספר העותק עבור כל מטרה באמצעות המשוואה הליניארית הנגזרת מהרגרסיה הליניארית.
לאחר מכן חשב את יעילות הגברת ה- PCR באמצעות הפרמטרים מהרגרסיה הליניארית של העקומה הסטנדרטית והמשוואה הנתונה. לאחר אימות פריימרים במונחים של אחוז היעילות שלהם, לחשב את מספר העותק המוחלט של ה- DNA. ספירה זמנית של ייצור ספונטני פחות פרופאג'ים הצביעה על מספרי PFU הנמוכים ביותר לתא לאחר שעתיים ומספרי PFU הגבוהים ביותר לתא לאחר שש שעות.
הליזוגן היה אז יציב ביותר לאחר שעתיים. אז מצב זה שימש פרופיל QRTPCR. נצפתה עלייה ניכרת בביטוי הגן cro, סמן מוקדם של שכפול ליטי מ-2.31 כפול 10 לעותק התשיעי בתרביות לא מושרות ל-3.02 כפול 10 לעותק ה-11 30 דקות לאחר הזירוז.
באופן דומה, חלבוני P ו-O, סמן השלב האמצעי של שכפול ליטי, הראה גם הוא עלייה משמעותית מ-1.74 כפול 10 לשמיני ל-1.25 כפול 10 לעותק העשירי, ומ-6.05 כפול 10 לשני ל-5.68 כפול 10 לעותק החמישי בהתאמה. הסמן המאוחר של מחזור השכפול הליטי הראה עלייה ניכרת בביטוי בתרבויות לא מושרות ל-30 דקות לאחר האינדוקציה. מבין הבקרות הפנימיות שנבדקו, RPOD היה בעל הביטוי היציב ביותר בהשוואה ל -16 גנים SRNA או ProC.
בהשוואה לסמנים לשכפול ליטי, הביטוי של הגן C-one היה יציב יחסית. עם זאת, מספר ההעתקה של הגן C-one היה גבוה באופן מרגיע בתרביות שלא נוצרו, בהשוואה לסמנים לשכפול ליטי. שום נתונים או פרשנויות טובות לא יכולים להגיע מספריית רנ"א שהוכנה בצורה גרועה.
שליטה באינדוקציה ספונטנית ובשלמות הרנ"א הם הדברים החשובים ביותר. ניתן לחקור דינמיקה טמפורלית של כל גן באמצעות פרופיל ביטוי. התאמת תנאי הניסוי ונקודות הזמן הנכונים חשובה למיפוי נכון של תגובות ביולוגיות לכל גירוי.
טכניקה זו זיהתה אינטראקציות שלא היו ידועות קודם לכן בין שתי שותפויות מארח פרופאגים נפרדות. מאחר שרוב החיידקים מאכלסים פרופגים שלא נחקרו, גישה זו יכולה לעזור לגלות מטרות או יישומים טיפוליים חדשים רבים.
