تتحكم إشارات الشق في قرار الكبريتات والأنماط أثناء التطوير في metazoans. لقد طورنا مقايسة امتصاص الأجسام المضادة لوضع علامات على الشق ligand delta-D وتصوير الاتجار داخل الخلايا في أسلاف الدبقية الشعاعية في الدماغ الأمامي لأسماك الحمار الوحشي النامية. يتيح حقن البطين الدماغي المخفي لسمك الزرد امتصاص انتقائي ل AntiDld-Atto-647N بواسطة أسلاف الخلايا الدبقية الشعاعية العضلية التي تبطن البطينين الدماغيين في التطور بكفاءة عالية وتأثيرات طويلة الأمد.
يمكن دمج هذا البروتوكول بسهولة مع الاضطرابات الدوائية أو الجينية الأخرى المستخدمة في مراحل النمو المختلفة وربما تتكيف مع الدماغ البالغ وكذلك الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات المشتقة من 2D أو 3D الدماغ. بعد توليد الأجنة المخصبة واحتضانها لمدة 18 إلى 20 ساعة ، قم بإزالتها من الحاضنة. راقبها تحت مجهر التألق باستخدام الضوء الأبيض أولا بتكبير 20 مرة.
تخلص من الأجنة الميتة التي تبدو غائمة أو ممزقة تحت المجهر باستخدام ماصة زجاجية. ثم قم بتشغيل مصباح الفلورسنت واختر إعداد مرشح RFP للمجهر. حدد الأجنة ذات التألق الأحمر القوي وانقلها إلى طبق جديد بماء البيض.
الآن قم بإزالة الأجنة يدويا باستخدام ملقطين دقيقين تحت الضوء الأبيض. امسك المشيم بزوج واحد من الملقط وقم بعمل تمزق في المشيم بالملقط الآخر. افتح المسيل للدموع بعناية باستخدام الملقط واجعله كبيرا بما يكفي لمرور الجنين عن طريق دفع الجنين برفق بأطراف الملقط الآخر.
انقل الأجنة المنزوعة الأيونات إلى طبق بتري جديد بوسط جنيني طازج لشطف سريع قبل الحقن المجهري. بعد سحب إبر الحقن الدقيقة على مجتذب ، افتح طرف الإبرة بالملقط تحت مجهر تشريح ستيريو. اجعل قطر الطرف حوالي 10 ميكرومتر وزاوية الاستدقاق حوالي 30 درجة.
الآن امزج 0.5 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل Dld مع ميكرولتر من الجسم المضاد للفأر L G Atto-647N عن طريق سحب خمس إلى 10 مرات لاقترانها واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. في نهاية الحضانة ، أضف 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع و 0.5 ميكرولتر من 0.5٪ فينول أحمر إلى خليط الأجسام المضادة واخلطه عن طريق السحب لمنع أي أجسام مضادة غير مقترنة متبقية في الخليط. بعد ذلك ، تحضير 1٪ نقطة انصهار منخفضة agarose في وسط الجنين.
سخني الخليط المحتوي على الأغاروز على حرارة 70 درجة مئوية حتى يصبح الخليط شفافا. بعد اقتباس محلول الأغاروز ، احتفظ بها في كتلة حرارية عند 40 درجة مئوية. شطف الجنين في أنبوب يحتوي على 1٪ نقطة انصهار منخفضة agarose لمدة ثلاث ثوان.
ضع الجنين على غطاء طبق بتري بلاستيكي مقلوب مع قطرات أغاروز فردية لتركيب كل جنين على حدة. ضع الأجنة بشكل مسطح بشكل جانبي في الأغاروز وحافظ على هذا الوضع حتى يتجمد الأغاروز في درجة حرارة الغرفة. تغطية جميع الأجنة المركبة في agarose مع وسط البيض.
ضع الأجنة المضمنة تحت المجهر الاستريو وقم بتغطية الأغاروز بماء البيض. اضبط حاقن ضغط الهواء باستخدام معالجات دقيقة ، وضعها بالقرب من المجاهر. استخدم أسطوانة الغاز الفولاذية التي تحتوي على النيتروجين الغازي تحت ضغط عال كمورد للهواء.
بمجرد تركيب الأجنة في الأغاروز ، افتح صمام الغاز. أثناء استخدام وحدة التعبئة الأمامية للحاقن الصغير ، قم بتحميل الإبرة الزجاجية المحضرة مسبقا بميكرولتر من خليط الأجسام المضادة على المناور الدقيق. الآن اضبط ضغط الإدخال على 80 إلى 90 رطلا لكل بوصة مربعة وضغط الحقن إلى 20 رطلا لكل بوصة مربعة.
معايرة حجم الحقن باستخدام ميكرومتر تحت المجهر. اضبط مدة وقت الضبط وفقا لحجم فتحة الإبرة من 10 إلى 120 مللي ثانية. اضغط على المجداف لتوصيل كل نبضة حقن وضبط حجم الحقن لكل عملية تسليم إلى أربعة إلى خمسة نانولترات.
ثم قم بوخز طرف إبرة الحقن الدقيقة من خلال لوحة السقف الظهري للدماغ الخلفي ، خلف نقطة مفصلية رونديمير صفر واحد وحقن حوالي 10 نانولتر من خليط الأجسام المضادة دون ضرب أنسجة المخ. لاحظ تدفق السوائل الحمراء في بطين الدماغ. بعد الحقن ، قم بإزالة طرف الإبرة من الجنين بسرعة عن طريق تدوير مقبض المعالج الدقيق.
للحصول على حقن ناجح ، تبقى الصبغة الحمراء للخليط المحقون في بطين الدماغ بثبات دون أن تتسرب إلى الأغاروز المحيط. حرك لوحة التثبيت تحت المجهر لتحديد موقع جنين مركب آخر في وضع مناسب للتكرار. بعد حقن ستة إلى ثمانية أجنة ، قشر الأغاروز بسكين جراحي مجهري لتحرير الأجنة من الأغاروز المدمج.
انقل الأجنة المحقونة الدقيقة إلى طبق طازج يحتوي على 30 ملليلتر من وسط الجنين وضعها في درجة حرارة الغرفة للخطوات التالية. بعد 30 دقيقة ، انقل الأجنة المختارة إلى 10 ملليلتر من وسط الجنين. لتركيب الأجنة ، قم بإعداد أغاروز منخفض نقطة انصهار بنسبة 0.8٪ يحتوي على نفس تركيز التريكان في الأنبوب.
استخدم ماصة زجاجية لغمر الأجنة المحقونة في الأغاروز الدافئ لمدة ثلاث ثوان. ثم قم على الفور بإزالة الأجنة من الأغاروز بنفس الماصة الزجاجية وضع الأجنة في وسط أطباق الثقافة الزجاجية ذات القاع الزجاجي 35 ملم مع قطرة من الأغاروز من الأنبوب. قم بتوجيه الأجنة برفق باستخدام مسبار الألياف أو طرف التحميل لإبقاء الجانب الظهري من الدماغ الجنيني قريبا من القاع الزجاجي قدر الإمكان.
أدر موضع الجنين برفق لتمديد الجنين دون تجعيد الشعر حيث يتجمد الأغاروز تدريجيا. بعد ذلك ، تحقق من موضع الجنين عن طريق قلب الطبق السفلي الزجاجي. تأكد من أن الدماغ الأمامي الظهري بالكامل مع الأجنة المثبتة بشكل صحيح يمكن رؤيته تحت المجهر.
أضف ملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من 28.5 درجة مئوية وسط جنيني مسخن مسبقا يحتوي على تريكان لتغطية الجنين. ضع الطبق بشكل صحيح على مرحلة التحكم في درجة حرارة المجهر متحد البؤر واضبط درجة حرارة غرفة التصوير على 28.5 درجة مئوية. الجنين جاهز الآن للتصوير.
أظهرت الأجنة المحقونة Atto-647N مضان الخلفية في بطين الدماغ. أظهرت أجنة الزرد المحقونة المضادة ل Dld-Atto-647N كميات كبيرة من جزيئات الفلورسنت الداخلية في معظم خلايا الدماغ الأمامي النامي. أظهر التصوير بفاصل زمني حركة الإندوسومات المضادة ل Dld-Atto-647N داخل الخلايا أثناء انقسام الخلايا.
أظهرت معظم أسلاف الدبقية الشعاعية الانقسامية فصلا غير متماثل أمامي أو خلفي للإندوسومات المضادة ل Dld-Atto-647N إلى خليتين ابنتين. استقر عدم التماثل في نهاية الطور ، مما أدى إلى وراثة غير متماثلة من إندوسومات إشارات الشق بواسطة الخلايا الابنة بعد ذلك. تأكد من وضع الإبرة في البطين المخفي في المكان المناسب وتحقق مما إذا كان هناك أي تسرب بعد الحقن المجهري.
بالإضافة إلى وضع علامات على إشارات دلتا ، فإن البروتوكول قابل للتطبيق لوضع علامات على بروتين الغشاء الآخر أو البروتينات خارج الخلية باستخدام استراتيجيات مماثلة ، إذا كان الجسم المضاد الجيد للمجال خارج الخلية متاحا.
