إن عزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية المشتقة من أنسجة الجدرة هي الأساس لمزيد من الدراسات على الجدرة. يمكن الحصول على الخلايا الليفية من أنسجة الجدرة بسهولة من خلال هذا البروتوكول ، والذي يمكن أن يوفر مصدرا وفيرا ومستقرا للخلايا في المختبر لأبحاث الجدرة. ابدأ باستخدام ملاقط معقمة لوضع أنسجة الجدرة في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 ملليلتر يحتوي على 10 إلى 25 ملليلتر من PBS مكمل ب 1٪ PSA.
وفي الوقت نفسه ، أضف أربعة ملليلتر من محلول PBS PSA إلى كل بئر من صفيحة من ستة آبار. الآن أخرج المنديل من الأنبوب ، واغسله مرتين بمحلول PBS PSA. باستخدام زوج من الملقط المعقم ، انقل الأنسجة بالتتابع من بئر إلى آخر.
ثم قم بإزالة الطبقات الدهنية والبشرة بالمقص الجراحي ، وترك الأدمة دون مساس. استخدم مقصا لتشريح الأدمة المشذبة إلى قطع من ثلاثة إلى خمسة ملليمترات مربعة ونقل القطع إلى البئر التالي باستخدام ملقط معقم. اغسل القطع في محلول PBS PSA.
باستخدام ملقط معقم ، ضع 10 إلى 30 قطعة من أنسجة الأدمة متباعدة أقل من خمسة ملليمترات في أطباق بتري. ضع الأطباق رأسا على عقب في حاضنة حتى تجف القطع وتلتصق بالطبق. بعد ذلك ، أضف سبعة ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ PSA ، واحتضان الأطباق كما كان من قبل.
بعد ثلاثة أيام ، استبدل نصف المادة الطافية بوسط استزراع كامل. راقب الخلايا الليفية يوميا تحت التكبير المجهري 40X. قم بإزالة قطع الأنسجة في وسط المزرعة عندما تصل الخلايا الليفية إلى التقاء 90٪.
اغسل الخلايا الليفية في برنامج تلفزيوني وأضف ملليلتر من محلول التربسين المعقم EDTA. بعد احتضان الخلايا في حاضنة رطبة ، اضغط برفق على طبق الثقافة وراقبه تحت المجهر. أضف ملليلتر من الوسط الكامل إلى نهاية عملية الهضم بمجرد انفصال معظم الخلايا.
الآن نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي معقم 15 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 300G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط كامل. زرع الخلايا الليفية في طبق زراعة الخلايا تسعة سنتيمترات واحتضانها في حاضنة مرطبة.
لإجراء تحليل الفلورسنت المناعي بعد زراعة الخلايا الليفية على أغطية مستديرة واحتضانها في الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، أضف 50 ميكرولترا من محلول DAPI إلى الشريحة الزجاجية لتلطيخ النوى الخلوية. ضع أغطية الأغطية المغسولة على شرائح زجاجية باستخدام ملقط. أخيرا ، انقل العينات إلى صندوق مظلم مبلل للفحص المجهري الفلوري.
لوحظت نمو الخلايا الليفية للأنسجة في خمسة أيام بعد المعالجة. أظهرت الخلايا الليفية معدلات انتشار عالية ووصلت إلى نقطة التقاء بعد 10 أيام. كانت الخلايا الليفية تحتوي على أجسام خلوية ممدودة وشبيهة بالمغزل ، والتي تمت محاذاتها في حزم عند التقاء عالي.
عاد تلطيخ المناعي المناعي تألقا مناعيا أحمر إيجابيا للخلايا الليفية وتألقا مناعيا أزرق للنواة الخلوية. أظهرت مقايسات التدفق الخلوي إيجابية CD90 في جميع الخلايا الليفية تقريبا. وصفت هذه الدراسة طريقة محسنة وقدمت تعليمات واضحة لحل التحديات الحالية وزيادة فرصة النجاح لعزل وثقافة الخلايا الليفية الجدرة.
