Isolement, culture et caractérisation des fibroblastes cutanés primaires à partir de tissus chéloïdes humains

L’isolement et la culture de fibroblastes primaires dérivés de tissus chéloïdes sont la base d’autres études sur les chéloïdes. Les fibroblastes du tissu chéloïde peuvent être facilement acquis grâce à ce protocole, qui peut fournir une source abondante et stable de cellules dans le laboratoire pour la recherche chéloïde. Commencez par utiliser une pince à épiler stérile pour placer le tissu chéloïde dans un tube centrifuge stérile de 50 millilitres contenant 10 à 25 millilitres de PBS complété par 1% de PSA.

Pendant ce temps, ajoutez quatre millilitres de solution PBS PSA à chaque puits d’une plaque de six puits. Maintenant, retirez le mouchoir du tube et lavez deux fois avec une solution de PBS PSA. À l’aide d’une paire de pinces stériles, transférez le tissu séquentiellement d’un puits à l’autre.

Ensuite, retirez les couches adipeuses et épidermiques avec des ciseaux chirurgicaux, laissant le derme intact. Utilisez une paire de ciseaux pour disséquer le derme taillé en morceaux de trois à cinq millimètres carrés et transférez les morceaux au puits suivant avec une paire de pinces stériles. Lavez les morceaux dans une solution PBS PSA.

À l’aide de pinces stérilisées, placer 10 à 30 morceaux de tissu dermique espacés de moins de cinq millimètres dans des boîtes de Pétri. Placez les plats à l’envers dans un incubateur jusqu’à ce que les morceaux sèchent et collent au plat. Ensuite, ajoutez sept millilitres de DMEM complétés par 10% FBS et 1% PSA, et incuber les plats comme avant.

Après trois jours, remplacer la moitié du surnageant par un milieu de culture complet. Observez les fibroblastes quotidiennement sous un grossissement microscopique de 40X. Retirez les morceaux de tissu dans le milieu de culture lorsque les fibroblastes atteignent 90% de confluence.

Lavez les fibroblastes dans du PBS et ajoutez deux millilitres de solution stérile de trypsine EDTA. Après avoir incubé les cellules dans un incubateur humidifié, tapotez doucement le plat de culture et observez-le au microscope. Ajouter deux millilitres de milieu complet pour terminer la digestion une fois que la plupart des cellules se sont détachées.

Maintenant, transférez la suspension cellulaire dans un tube centrifuge stérile de 15 millilitres et centrifugez le tube à 300G pendant trois minutes à température ambiante. Jeter soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu complet. Ensemencez les fibroblastes dans une boîte de culture cellulaire de neuf centimètres et incuber dans un incubateur humidifié.

Pour effectuer une analyse immunofluorescente après avoir cultivé les fibroblastes sur des lamelles de couverture rondes et les avoir incubés dans des anticorps primaires et secondaires, ajoutez 50 microlitres de solution DAPI à la lame de verre pour colorer les noyaux cellulaires. Placez les lames de couverture lavées sur des lames de verre à l’aide de pinces. Enfin, transférez les échantillons dans une boîte sombre humide pour la microscopie fluorescente.

Des excroissances de fibroblastes du tissu ont été observées cinq jours après le traitement. Les fibroblastes ont affiché des taux de prolifération élevés et ont atteint la confluence après 10 jours. Les fibroblastes avaient des corps cellulaires allongés et fusiformes, qui étaient alignés en faisceaux à forte confluence.

La coloration immunofluorescente a renvoyé une immunofluorescence rouge positive des fibroblastes et une immunofluorescence bleue du noyau cellulaire. Les tests de cytométrie en flux ont montré une positivité de CD90 dans presque tous les fibroblastes. Cette étude a décrit une méthode optimisée et fourni des instructions claires pour résoudre les défis existants et augmenter les chances de succès pour l’isolement et la culture des fibroblastes chéloïdes.