켈로이드 조직에서 유래한 일차 섬유아세포의 분리 및 배양은 켈로이드에 대한 추가 연구의 기초입니다. 켈로이드 조직의 섬유아세포는 이 프로토콜을 통해 쉽게 획득할 수 있으며, 이는 켈로이드 연구를 위한 실험실에서 풍부하고 안정적인 세포 공급원을 제공할 수 있습니다. 멸균 핀셋을 사용하여 1% PSA가 보충된 PBS 10-25밀리리터가 들어 있는 50밀리리터 멸균 원심분리기 튜브에 켈로이드 조직을 넣는 것으로 시작합니다.
한편, 4 밀리리터의 PBS PSA 용액을 6-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 이제 튜브에서 티슈를 꺼내고 PBS PSA 용액으로 두 번 씻으십시오. 한 쌍의 멸균 집게를 사용하여 조직을 한 우물에서 다음 우물로 순차적으로 옮깁니다.
그런 다음 수술 용 가위로 지방층과 표피층을 제거하고 진피는 그대로 둡니다. 가위를 사용하여 손질 된 진피를 3-5 평방 밀리미터 조각으로 해부하고 한 쌍의 멸균 집게로 조각을 다음 우물로 옮깁니다. PBS PSA 용액으로 조각을 씻으십시오.
멸균 된 집게를 사용하여 10-30 개의 진피 조직 조각을 페트리 접시에 5mm 미만의 간격으로 놓습니다. 조각이 마를 때까지 인큐베이터에 접시를 거꾸로 놓고 접시에 붙입니다. 다음으로, 10% FBS 및 1% PSA가 보충된 7밀리리터의 DMEM을 첨가하고, 이전과 같이 접시를 배양한다.
3 일 후, 상청액의 절반을 완전한 배양 배지로 교체하십시오. 섬유아세포를 매일 40X 현미경 배율로 관찰합니다. 섬유아세포가 90% 밀도에 도달하면 배양 배지에서 조직 조각을 제거합니다.
섬유아세포를 PBS로 세척하고 멸균 트립신 EDTA 용액 2밀리리터를 첨가한다. 가습 인큐베이터에서 세포를 배양한 후 배양 접시를 가볍게 두드려 현미경으로 관찰합니다. 대부분의 세포가 분리되면 소화를 끝내기 위해 2 밀리리터의 완전한 배지를 추가하십시오.
이제 세포 현탁액을 15 밀리리터 멸균 원심 분리 튜브로 옮기고 실온에서 3 분 동안 300G에서 튜브를 원심 분리합니다. 상층액을 조심스럽게 버리고 세포 펠릿을 완전한 배지에 재현탁하십시오. 섬유아세포를 9cm 세포 배양 접시에 파종하고 가습 인큐베이터에서 배양합니다.
둥근 커버슬립에서 섬유아세포를 배양하고 1차 및 2차 항체에서 배양한 후 면역형광 분석을 수행하려면 유리 슬라이드에 50마이크로리터의 DAPI 용액을 추가하여 세포핵을 염색합니다. 집게를 사용하여 세척 된 커버 슬립을 유리 슬라이드에 놓습니다. 마지막으로 형광 현미경 검사를 위해 샘플을 습식 다크 박스로 옮깁니다.
조직의 섬유아세포 성장은 처리 후 5일째에 관찰되었다. 섬유아세포는 높은 증식률을 보였고 10일 후에 합류도에 도달했습니다. 섬유아세포는 길쭉하고 방추형의 세포체를 가지고 있었고, 이들은 높은 밀도로 다발로 정렬되어 있었다.
면역형광 염색은 섬유아세포의 양성 적색 면역형광과 세포핵의 청색 면역형광을 반환했습니다. 유세포 분석은 거의 모든 섬유아세포에서 CD90 양성을 보여주었습니다. 이 연구는 최적화된 방법을 설명하고 기존 문제를 해결하고 켈로이드 섬유아세포의 분리 및 배양에 대한 성공 가능성을 높이기 위한 명확한 지침을 제공했습니다.
