ケロイド組織に由来する初代線維芽細胞の単離と培養は、ケロイドのさらなる研究の基礎となります。ケロイド組織からの線維芽細胞は、このプロトコルを介して容易に取得することができ、ケロイド研究のための実験室で豊富で安定した細胞源を提供することができます。滅菌ピンセットを使用して、1%PSAを添加した10〜25ミリリットルのPBSを含む50ミリリットルの滅菌遠心チューブにケロイド組織を配置することから始めます。
その間、4ミリリットルのPBS PSA溶液を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。次に、ティッシュをチューブから取り出し、PBS PSA溶液で2回洗浄します。一対の滅菌鉗子を使用して、組織をあるウェルから次のウェルに順次移します。
次に、外科用ハサミで脂肪層と表皮層を取り除き、真皮をそのままにします。ハサミを使用して、トリミングされた真皮を3〜5平方ミリメートルの小片に解剖し、滅菌鉗子で次のウェルに移します。PBS PSA溶液でピースを洗浄します。
滅菌した鉗子を使用して、10〜30個の真皮組織片を5ミリメートル未満の間隔でペトリ皿に置きます。破片が乾いて皿にくっつくまで、皿を逆さまにしてインキュベーターに入れます。次に、10%FBSと1%PSAを添加した7ミリリットルのDMEMを加え、前と同じように皿をインキュベートします。
3日後、上清の半分を完全培養液と交換する。線維芽細胞を40倍の顕微鏡倍率で毎日観察します。線維芽細胞が90%コンフルエントに達したら、培養液中の組織片を除去します。
線維芽細胞をPBSで洗浄し、2ミリリットルの滅菌トリプシンEDTA溶液を加える。加湿インキュベーターで細胞をインキュベートした後、培養皿を軽くたたき、顕微鏡で観察します。2ミリリットルの完全培地を加えて、ほとんどの細胞が剥離したら消化を終了します。
次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの滅菌遠心チューブに移し、チューブを300Gで室温で3分間遠心分離します。上清を注意深く廃棄し、細胞ペレットを完全培地に再懸濁します。線維芽細胞を9cmの細胞培養皿に播種し、加湿したインキュベーターでインキュベートします。
丸いカバーガラス上で線維芽細胞を培養し、一次抗体と二次抗体でインキュベートした後、免疫蛍光分析を行うには、スライドガラスに50マイクロリットルのDAPI溶液を加えて細胞核を染色します。洗浄したカバーガラスを鉗子を使用してスライドガラスに置きます。最後に、サンプルを蛍光顕微鏡用の湿った暗箱に移します。
処理後5日目に組織の線維芽細胞伸長が観察された。線維芽細胞は高い増殖率を示し、10日後にコンフルエントに達した。線維芽細胞は細長い紡錘状の細胞体を有し、それらは高いコンフルエント性で束に整列していた。
免疫蛍光染色は、線維芽細胞の赤色免疫蛍光および細胞核の青色免疫蛍光を陽性に戻した。フローサイトメトリーアッセイは、ほぼすべての線維芽細胞においてCD90陽性を示した。この研究では、最適化された方法を説明し、既存の課題を解決し、ケロイド線維芽細胞の分離と培養の成功の可能性を高めるための明確な指示を提供しました。
