Die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe sind die Grundlage für weitere Untersuchungen von Keloiden. Fibroblasten aus Keloidgewebe können durch dieses Protokoll leicht gewonnen werden, was eine reichhaltige und stabile Quelle von Zellen im Labor für die Keloidforschung darstellen kann. Beginnen Sie mit einer sterilen Pinzette, um das Keloidgewebe in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu geben, das 10 bis 25 Milliliter PBS enthält, das mit 1 % PSA angereichert ist.
In der Zwischenzeit fügen Sie vier Milliliter PBS-PSA-Lösung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte hinzu. Nehmen Sie nun das Gewebe aus der Tube und waschen Sie es zweimal mit PBS-PSA-Lösung. Übertragen Sie das Gewebe mit einer sterilen Pinzette nacheinander von einer Vertiefung in die nächste.
Entfernen Sie dann die Fett- und Epidermisschichten mit einer chirurgischen Schere, wobei die Dermis unberührt bleibt. Verwenden Sie eine Schere, um die getrimmte Dermis in drei bis fünf Quadratmillimeter große Stücke zu zerlegen und die Stücke mit einer sterilen Pinzette in die nächste Vertiefung zu übertragen. Waschen Sie die Stücke in PBS PSA-Lösung.
Legen Sie mit einer sterilisierten Pinzette 10 bis 30 Dermisgewebestücke mit einem Abstand von weniger als fünf Millimetern in Petrischalen. Stellen Sie die Schalen kopfüber in einen Inkubator, bis die Stücke trocken sind und an der Schale kleben. Als nächstes fügen Sie sieben Milliliter DMEM hinzu, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % PSA, und inkubieren Sie die Schalen wie zuvor.
Nach drei Tagen wird die Hälfte des Überstandes durch ein vollständiges Nährmedium ersetzt. Beobachten Sie die Fibroblasten täglich unter 40-facher mikroskopischer Vergrößerung. Entfernen Sie die Gewebestücke im Kulturmedium, wenn die Fibroblasten eine Konfluenz von 90 % erreichen.
Waschen Sie die Fibroblasten in PBS und fügen Sie zwei Milliliter sterile Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Nachdem Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator inkubiert haben, klopfen Sie vorsichtig auf die Kulturschale und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop. Fügen Sie zwei Milliliter des vollständigen Mediums hinzu, um die Verdauung zu beenden, sobald sich die meisten Zellen abgelöst haben.
Füllen Sie nun die Zellsuspension in ein steriles 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen um und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300G für drei Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Zellpellet in vollständigem Medium. Säen Sie die Fibroblasten in eine neun Zentimeter große Zellkulturschale und inkubieren Sie sie in einem befeuchteten Inkubator.
Um eine Immunfluoreszenzanalyse durchzuführen, nachdem die Fibroblasten auf runden Deckgläsern kultiviert und in primären und sekundären Antikörpern inkubiert wurden, geben Sie 50 Mikroliter DAPI-Lösung in den Objektträger, um die Zellkerne zu färben. Legen Sie die gewaschenen Deckgläser mit einer Pinzette auf Objektträger. Zum Schluss überführen Sie die Proben in eine feuchte Dunkelbox für die Fluoreszenzmikroskopie.
Fibroblastenauswüchse des Gewebes wurden fünf Tage nach der Verarbeitung beobachtet. Die Fibroblasten zeigten hohe Proliferationsraten und erreichten nach 10 Tagen eine Konfluenz. Die Fibroblasten besaßen längliche und spindelartige Zellkörper, die in Bündeln mit hoher Konfluenz angeordnet waren.
Die Immunfluoreszenzfärbung ergab eine positive rote Immunfluoreszenz der Fibroblasten und eine blaue Immunfluoreszenz des Zellkerns. Durchflusszytometrische Assays zeigten CD90-Positivität in fast allen Fibroblasten. Diese Studie hat eine optimierte Methode beschrieben und klare Anweisungen gegeben, um bestehende Herausforderungen zu lösen und die Erfolgschancen für die Isolierung und Kultur von Keloid-Fibroblasten zu erhöhen.
