Keloid dokusundan türetilen primer fibroblastların izolasyonu ve kültürü, keloidlerin daha ileri çalışmaları için temel oluşturur. Keloid dokusundan fibroblastlar, keloid araştırmaları için laboratuvarda bol ve stabil bir hücre kaynağı sağlayabilen bu protokol aracılığıyla kolayca elde edilebilir. Keloid dokusunu% 1 PSA ile desteklenmiş 10 ila 25 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik steril bir santrifüj tüpüne yerleştirmek için steril cımbız kullanarak başlayın.
Bu arada, altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dört mililitre PBS PSA çözeltisi ekleyin. Şimdi dokuyu tüpten çıkarın ve PBS PSA çözeltisi ile iki kez yıkayın. Bir çift steril forseps kullanarak, dokuyu sırayla bir kuyudan diğerine aktarın.
Daha sonra yağ ve epidermis katmanlarını cerrahi makasla çıkarın, dermise dokunmayın. Kesilen dermisi üç ila beş milimetre karelik parçalara ayırmak için bir makas kullanın ve parçaları bir çift steril forseps ile bir sonraki kuyuya aktarın. Parçaları PBS PSA solüsyonunda yıkayın.
Sterilize edilmiş forseps kullanarak, Petri kaplarına beş milimetreden daha az aralıklarla yerleştirilmiş 10 ila 30 dermis doku parçası yerleştirin. Bulaşıkları, parçalar kuruyana kadar bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin ve tabağa yapıştırın. Daha sonra,% 10 FBS ve% 1 PSA ile desteklenmiş yedi mililitre DMEM ekleyin ve bulaşıkları daha önce olduğu gibi inkübe edin.
Üç gün sonra, süpernatantın yarısını tam kültür ortamıyla değiştirin. Fibroblastları günlük olarak 40X mikroskobik büyütme altında gözlemleyin. Fibroblastlar% 90'a ulaştığında kültür ortamındaki doku parçalarını çıkarın.
Fibroblastları PBS'de yıkayın ve iki mililitre steril tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe ettikten sonra, kültür kabına hafifçe vurun ve mikroskop altında gözlemleyin. Hücrelerin çoğu ayrıldıktan sonra sindirimi sona erdirmek için iki mililitre tam ortam ekleyin.
Şimdi hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın ve hücre peletini tam ortamda yeniden süspanse edin. Fibroblastları dokuz santimetrelik bir hücre kültürü kabına tohumlayın ve nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
Fibroblastları yuvarlak lameller üzerinde kültürledikten ve bunları birincil ve ikincil antikorlarda inkübe ettikten sonra immünofloresan analizi yapmak için, hücresel çekirdeği boyamak için cam slayta 50 mikrolitre DAPI çözeltisi ekleyin. Yıkanmış lamelleri forseps kullanarak cam slaytların üzerine yerleştirin. Son olarak, numuneleri floresan mikroskobu için ıslak bir karanlık kutuya aktarın.
İşlemden beş gün sonra dokuda fibroblast büyümesi gözlendi. Fibroblastlar yüksek proliferasyon oranları gösterdi ve 10 gün sonra birleşmeye ulaştı. Fibroblastlar, yüksek birleşmede demetler halinde hizalanmış uzun ve iğ benzeri hücre gövdelerine sahipti.
İmmünofloresan boyama, fibroblastların pozitif kırmızı immünofloresansını ve hücresel çekirdeğin mavi immünofloresansını döndürdü. Flow sitometrik testler hemen hemen tüm fibroblastlarda CD90 pozitifliği gösterdi. Bu çalışma, optimize edilmiş bir yöntemi tanımlamış ve mevcut zorlukları çözmek ve keloid fibroblastların izolasyonu ve kültürü için başarı şansını artırmak için net talimatlar sağlamıştır.
