Questa ricerca è stata fondata dalla Società di Ricerca Tedesca (BO5534). Ringraziamo Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, la Dott.ssa Annika Heuer e il PD Dr. Ingo Königs per averci fornito i campioni. Inoltre, gli autori ringraziano il team della UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) per il supporto con la microscopia a immunofluorescenza.

Questo studio ha incluso tessuti di topo derivati da esperimenti approvati dall'Amministrazione statale di Amburgo per la ricerca sugli animali, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Amburgo, Germania (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). I tessuti utilizzati erano polmone e colon di topo da un modello settico e pelle ustionata. Abbiamo usato topi maschi e femmine di 8 settimane. Per tutti gli esperimenti è stata seguita la Direttiva Europea 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. I campioni umani anonimizzati includevano tessuti di enterocolite neonatale, pelle ustionata, atresia biliare, spondilodiscite e miocardio. Secondo il Comitato etico per la ricerca medica di Amburgo, i campioni non avevano bisogno del consenso informato, ma lo studio è stato approvato dal comitato (WF-026/21).
1. Fissaggio del campione
<ol><li>Utilizzare il seguente protocollo derivato da Abu Abed e Brinkmann per la fissazione del campione, la disidratazione, l'inclusione della paraffina, il sezionamento e il montaggio 3,15.<ol><li>Preparare una soluzione di formaldeide al 4% sciogliendo 40 g di paraformaldeide (PFA) in 800 mL di soluzione salina tamponata con Tris, pH 7,4 (TBS).</li>
		<li>Mescolare la miscela a 60 °C sotto una cappa aspirante fino a quando il PFA non si è sciolto. Portare la soluzione a temperatura ambiente (RT) e regolare il volume con TBS a 1.000 ml.</li>
		<li>Regolare il pH a 7,4. Conservare a 4 °C per 2-3 settimane o a -20 °C per un massimo di 1 anno.</li>
	</ol></li>
	<li>Per la fissazione del campione, posizionare il tessuto fresco nel tampone TBS e sezionarlo in pezzi di dimensioni inferiori a 20 mm x 30 mm x 3 mm. Immergere le sezioni di tessuto in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 12-24 ore. NOTA: Il protocollo originale utilizzava una soluzione di PFA al 2% e un tempo di fissazione di 8-20 ore. Con questo metodo, alcune sezioni di tessuto non sono state completamente fissate dopo 20 ore, quindi la concentrazione di PFA è stata aumentata al 4% di PFA.</li>
	<li>Trasferire i campioni in cassette per il trattamento dei tessuti etichettati. Utilizzare pennarelli o matite resistenti ai solventi per l'etichettatura.</li>
	<li>Iniziare la disidratazione del campione immergendo le cassette in etanolo al 70% per 1 ora. Quindi, immergere in etanolo all'80%, etanolo al 90%, etanolo al 96% e due volte all'etanolo al 100%, con ogni passaggio della durata di 1 ora.</li>
	<li>Immergere due volte in xilene al 100% (dimetilbenzene) e poi due volte in paraffina a 60 °C per 1 ora ogni volta.</li>
	<li>Utilizzare stampi da incasso per il montaggio e lasciare che la paraffina si solidifichi prima di rimuovere lo stampo.</li>
	<li>Utilizzare un microtomo per tagliare sezioni di tessuto spesse 3 μm.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta per stendere le sezioni tagliate a bagnomaria a 37 °C e lasciarle galleggiare sulla superficie per allungare i tagli di tessuto.</li>
	<li>Posizionare le sezioni su vetrini adesivi (Tabella dei materiali) e lasciarle asciugare per una notte in una camera termica a 40 °C.</li>
</ol>2. Reidratazione del campione
<ol><li>Per la deparaffinazione, impilare i vetrini in un rack per vetrini e immergerli due volte per 5 minuti ciascuno nel mezzo sostitutivo dello xilene limonene (Tabella dei materiali) e una volta per 5 minuti in una miscela 1:1 limonene/etanolo. ATTENZIONE: Il limonene è infiammabile a 50 °C e può causare reazioni allergiche. Utilizzare sotto una cappa aspirante con protezione per gli occhi e guanti. Tenere lontano dal fuoco aperto.</li>
	<li>Reidratare i campioni in una serie di etanolo discendente immergendo il rack dei vetrini due volte in etanolo al 100% e una volta in etanolo al 96%, etanolo al 90%, etanolo all'80% ed etanolo al 70% per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Immergere la griglia per vetrini per 5 minuti in acqua deionizzata (acqua deionizzata) per rimuovere eventuali residui di etanolo.</li>
</ol>3. Blocco dell'autofluorescenza e recupero dell'antigene
<ol><li>Preparare la soluzione di recupero del bersaglio del citrato (TRS) a pH 6 (Tabella dei materiali) secondo la scheda tecnica. Questo TRS è concentrato 10 volte. Pertanto, diluire 1:10 con acqua deionizzata. Preriscaldare in un barattolo di plastica a 96 °C. NOTA: TRS rompe i ponti di metilene formati durante la fissazione del campione per esporre gli epitopi dell'antigene. Ciò consente agli anticorpi primari di legarsi al loro antigene bersaglio. Conservare TRS concentrato a 2-8 °C per 8 mesi. Prepara sempre TRS fresco.</li>
	<li>Estrarre i vetrini dalla rastrelliera e riporli in una camera umida. Pipettare una o due gocce di agente autofluorescente (tabella dei materiali) su ciascun campione. Incubare per 5 min. NOTA: L'agente riducente dell'autofluorescenza blocca l'autofluorescenza intrinseca del tessuto causata da fluorofori e fissativi endogeni. Conservare l'agente autofluorescente a RT per un massimo di 1 anno. NOTA: Lavorare solo con piccole sezioni di tessuti per evitare che i campioni si secchino o superino il tempo di incubazione.</li>
	<li>Impilare nuovamente i vetrini nella griglia per vetrini e risciacquare per 1 minuto in etanolo al 60% con movimenti verso l'alto e verso il basso fino a quando tutto il reagente per la riduzione dell'autofluorescenza non utilizzato non è stato lavato via.</li>
	<li>Immergere la griglia per vetrini per 5 minuti in acqua deionizzata.</li>
	<li>Per il prelievo dell'antigene, trasferire i vetrini in un barattolo di colorazione con il TRS preriscaldato. Incubare per 10 minuti a 96 °C a bagnomaria. NOTA: Il bagnomaria a 96 °C può essere sostituito con un forno a microonde o una vaporiera se il TRS è preriscaldato a 96 °C e sono garantiti 10 minuti di incubazione a 96 °C.</li>
	<li>Estrarre il barattolo di colorazione e lasciarlo raffreddare lentamente a RT per circa 60-90 minuti. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui per un massimo di 4 ore, lasciando le diapositive nel TRS.</li>
	<li>Rimuovere il TRS, ma conservare i vetrini nel barattolo. Risciacquare due volte con soluzione salina tamponata Tris con Tween allo 0,05% (TBST, pH 7,4) per 3 minuti ciascuno per lavare via eventuali residui di TRS rimanenti.</li>
	<li>Per la permeabilizzazione, preparare Triton allo 0,2% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4, e riempirlo nel barattolo di colorazione per permeabilizzare i campioni per 10 minuti. NOTA: La permeabilizzazione migliora il legame degli anticorpi primari con le proteine bersaglio intracellulari nei campioni fissati.</li>
	<li>Sciacquare nuovamente i vetrini due volte in TBST per 3 minuti ogni volta.</li>
	<li>Preparare la camera umida e stendere i vetrini. Pulire l'acqua in eccesso dai vetrini con fazzoletti di carta. Circondare ogni campione con una penna barriera idrofobica per evitare che la soluzione anticorpale fuoriesca. NOTA: Non lasciare che i campioni si asciughino. È meglio lavorare con piccole sezioni.</li>
</ol>4. Blocco del legame anticorpale non specifico
<ol><li>Prelevare una soluzione bloccante pronta all'uso con siero d'asina (Tabella dei materiali) e pipettare una goccia su ogni campione. Incubare per 30 minuti a RT. NOTA: Questa fase di blocco riduce al minimo il legame dell'anticorpo secondario a siti di legame non specifici sul campione. Dopo aver bloccato questi epitopi aspecifici e aver applicato l'anticorpo primario, l'anticorpo secondario si legherà all'anticorpo primario e non interagirà con la superficie del tessuto. Questo reagente bloccante pronto all'uso viene conservato a 2-8 °C per 6 mesi.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione bloccante in eccesso dai vetrini picchiettando il bordo dei vetrini contro una superficie dura. Non risciacquarli.</li>
</ol>5. Anticorpo primario
<ol><li>Diluire gli anticorpi primari in tampone di diluizione degli anticorpi (Tabella dei materiali). Utilizzare circa 100 μL della soluzione finale per ogni campione. Per l'anticorpo NE e H3cit (R8) e l'isocontrollo, diluire a una concentrazione di 5 μg/mL. Per l'MPO e l'isocontrollo corrispondente, utilizzare 10 μg/mL. Preparare una provetta per ogni anticorpo primario e una per ogni anticorpo isocontrollato. NOTA: H3cit (R8)/MPO o NE/MPO e i loro isocontrolli possono essere combinati per la colorazione dei NET. Per la combinazione di H3cit (R8)/MPO, diluire a una concentrazione finale di 5 μg/mL per H3cit (R8) e 10 μg/mL per MPO a un volume finale di 100 μL per campione. Per NE/MPO, diluire a una concentrazione finale di 5 μg/mL per NE e 10 μg/mL per MPO fino a un volume finale di 100 μL per campione. Per l'isocontrollo, utilizzare la stessa concentrazione di ciascun anticorpo corrispondente. Utilizzare sempre un nuovo puntale per pipetta per ogni anticorpo utilizzato. Gli anticorpi primari possono essere conservati a 4 °C per 1-2 settimane e a -20 °C o -80 °C per un massimo di 1 anno.</li>
	<li>Con due campioni su un vetrino, utilizzarne uno per gli anticorpi isocontrol e uno per la diluizione degli anticorpi MPO/H3cit o MPO/NE. Utilizzare circa 100 μL per ogni campione e distribuire uniformemente la soluzione anticorpale. NOTA: Non lasciare che i campioni si asciughino. Fare attenzione a non confondere l'isocontrollo con gli anticorpi primari.</li>
	<li>Conservare in camera umida per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Il giorno successivo, prelevare la soluzione di anticorpi primari in eccesso dai vetrini e impilare i vetrini in una cuvetta. Risciacquare tre volte per 5 minuti ogni volta con TBST per lavare via la soluzione anticorpale primaria rimanente.</li>
</ol>6. Anticorpo secondario
<ol><li>Preparare la soluzione anticorpale secondaria. Utilizzare due diversi anticorpi secondari fluorescenti: asino-anti-capra per MPO e asino-anti-coniglio per la colorazione H3cit. Diluire ciascuno di essi a una concentrazione di 7,5 μg/mL con tampone di diluizione anticorpale (Tabella dei materiali). NOTA: Per la doppia colorazione, utilizzare due anticorpi fluorescenti con aree di eccitazione diverse e sovrapposizione spettrale minima. Combinare entrambi gli anticorpi secondari e diluire a una concentrazione finale di 7,5 μg/mL per ciascun anticorpo per un volume finale di 100 μL per campione. Proteggere gli anticorpi dalla luce. Gli anticorpi secondari possono essere conservati a 2-8 °C per 6-8 settimane o a -80 °C per un massimo di 1 anno.</li>
	<li>Tenere i vetrini nella camera umida e aggiungere 100 μL della soluzione anticorpale secondaria su ogni campione. Lasciarli incubare per 30 minuti a RT e al riparo dalla luce.</li>
	<li>Picchiettare la soluzione di anticorpi secondari in eccesso e impilare i vetrini nel rack per vetrini. Immergere tre volte per 5 minuti ciascuna in un barattolo colorante riempito di PBS per lavare via eventuali anticorpi non legati rimanenti.</li>
	<li>Preparare la soluzione di DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo) (Tabella dei materiali) e diluire a una concentrazione di 1 μg/mL con acqua deionizzata. Immergere il rack per vetrini in un barattolo di colorazione con la soluzione DAPI e incubare per 5 minuti a RT al buio. NOTA: DAPI è usato come colorante fluorescente per il DNA a doppio filamento. La soluzione DAPI preparata può essere utilizzata più volte. Conservare la soluzione DAPI preparata presso RT. Il concentrato DAPI può essere conservato a -20 °C per un massimo di 1 anno.</li>
	<li>Immergere il rack per vetrini per 5 minuti in un barattolo colorante con PBS per lavare via la soluzione DAPI in eccesso.</li>
</ol>7. Montaggio e conservazione dei campioni, analisi microscopica
<ol><li>Montare i campioni con vetrini coprioggetti e mezzo di montaggio (Tabella dei materiali). NOTA: Utilizzare solo piccole quantità di mezzo di montaggio e rimuovere il mezzo in eccesso con fazzoletti bagnati. Indossare guanti ed evitare di rimuovere accidentalmente qualsiasi mezzo dai vetrini coprioggetti o dai vetrini. Evitare la formazione di bolle e utilizzare tamponi di cotone per premere delicatamente sui vetrini coprioggetti per rimuovere eventuali bolle dai vetrini.</li>
	<li>Per l'imaging, utilizzare un microscopio a campo largo o un microscopio confocale. NOTA: Scattare prima un'immagine dell'isocontrollo. Ridurre il tempo di esposizione per i filtri a fluorescenza (ad eccezione del filtro blu per DAPI) fino a quando non viene rilevato quasi nessun segnale. Quindi, utilizzare questa impostazione per esaminare i campioni corrispondenti. Cerca le aree in cui è possibile rilevare un segnale fluorescente in ogni singolo campione utilizzando il canale di fluorescenza. Dopo aver scattato un'immagine dell'area, il programma genera un'immagine composta di tutti i canali e mostra i diversi segnali di fluorescenza come una sovrapposizione di diversi colori. L'immagine può quindi essere ulteriormente analizzata per la co-localizzazione con un software di imaging come ImageJ.</li>
	<li>Conservare i vetrini a 4 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
</ol>

Colorazione e imaging per visualizzare le trappole extracellulari dei neutrofili

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).</li><li>Abu Abed, U., Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+labelling+of+human+and+murine+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+tissue.">Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+traps+promote+thrombosis.">Extracellular DNA traps promote thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps.">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).</li><li>Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation.+Neutrophil+extracellular+traps+license+macrophages+for+cytokine+production+in+atherosclerosis.">Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis.</a> Science. 349 (6245), 316-320 (2015).</li><li>Schauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+neutrophil+extracellular+traps+limit+inflammation+by+degrading+cytokines+and+chemokines.">Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines.</a> Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).</li><li>Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+neutrophil+extracellular+traps+in+human+tissue+sections.">Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections.</a> BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).</li><li>de Buhr, N., von K&#246;ckritz-Blickwede, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+paraffin-embedded+tissue.">Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+detection+and+quantification+in+paraffin+embedded+samples+using+confocal+microscopy.">NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy.</a> Micron. 114, 1-7 (2018).</li><li>Savchenko, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+feline+arterial+thrombi+using+immunofluorescence+microscopy.">Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).</li><li>Stehr, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+drive+epithelial-mesenchymal+transition+of+human+colon+cancer.">Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer.</a> Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval:+Mechanisms+and+application+to+histochemistry.">Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li><li>Smyth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-vascular+interactions+drive+myeloperoxidase+accumulation+in+the+brain+in+Alzheimer's+disease.">Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue.">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).</li><li>Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+autofluorescence+quenching+techniques+on+formalin-fixed+chicken+tissues.">Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues.</a> Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVIG+regulates+the+survival+of+human+but+not+mouse+neutrophils.">IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+Multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo lavoro, abbiamo cercato di adattare e ottimizzare i protocolli esistenti per l'imaging dei NET a più tipi di tessuto, a partire dal processo di colorazione vero e proprio. Il primo passo fondamentale per questo metodo è la selezione degli anticorpi più adatti. Per NE, abbiamo provato un anticorpo NE da un ospite di topo su tessuto umano, che non ha mostrato alcuna colorazione affidabile rispetto a NE da un ospite di coniglio. Inoltre, Thålin et al. hanno proposto H3cit (R8) come anticorpo più specifico per...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated from:
Lavinia Sch&#246;enfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono state visualizzate per la prima volta da Brinkmann et al. come una via di morte cellulare diversa dall'apoptosi e dalla necrosi nel 20041. In questo percorso, i neutrofili rilasciano la loro cromatina decondensata nello spazio extracellulare per formare grandi strutture simili a ragnatele ricoperte di proteine antimicrobiche che erano precedentemente immagazzinate nei granuli o nel citosol. Queste proteine antimicrobiche includono l'elastasi neutrofila (NE), la mieloperossidasi (MPO) e l'istone citrullinato H3 (H3cit), comunemente usati per la rilevazione in immunofluorescenza indiretta dei NET2. Questo metodo non solo identifica la presenza quantitativa di queste proteine; infatti, ha il vantaggio di rilevare in modo specifico strutture simili a NET. Nei NET, le proteine menzionate co-localizzano con il DNA extracellulare, che può essere rilevato da una sovrapposizione dei segnali di fluorescenza di ciascuna proteina colorata e del DNA extracellulare. In contrasto con i segnali sovrapposti dovuti alla co-localizzazione extracellulare di DNA e proteine nei NET, i neutrofili intatti non mostrano alcuna co-localizzazione. In questo caso, i componenti NET sono solitamente immagazzinati separatamente nei granuli, nei nuclei e nel citosol3.
Sin dalla loro prima scoperta, è stato dimostrato che i NET svolgono un ruolo centrale in numerose malattie, in particolare quelle che coinvolgono l'infiammazione. I NET mostrano funzioni antimicrobiche durante l'infezione attraverso l'intrappolamento e l'uccisione di patogeni extracellulari nel sangue e nei tessuti 4,5. Tuttavia, i NET sono stati anche collegati a malattie autoimmuni e risposte iperinfiammatorie, come il lupus eritematoso sistemico, l'artrite reumatica e l'asma allergica 6,7,8. I NET promuovono la vaso-occlusione e l'infiammazione nell'aterosclerosi, nell'adesione piastrinica e si ipotizza che svolgano un ruolo nel cancro metastatico 9,10,11. Tuttavia, si ritiene che abbiano proprietà antinfiammatorie riducendo i livelli di citochine proinfiammatorie12. Mentre i NET stanno guadagnando sempre più interesse in un campo di ricerca più ampio, un solido metodo di rilevamento dei NET è fondamentale per la ricerca futura.
Anche se la visualizzazione dei NET in diversi tessuti mediante imaging a immunofluorescenza è complessa e richiede personalizzazione, a parte la microscopia elettronica, è attualmente uno dei metodi più rinomati per visualizzare le interazioni tra NET e cellule ed è utilizzato prevalentemente nei tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina (FFPE)13,14. Tuttavia, il confronto tra l'imaging NET è difficile, poiché diversi laboratori utilizzano i propri protocolli personalizzati. Questi protocolli si differenziano per l'uso di anticorpi, il recupero dell'antigene o il metodo di permeabilizzazione e sono spesso ottimizzati per un tipo specifico di tessuto 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.
Dopo che Brinkmann et al. hanno pubblicato il primo studio metodico che utilizza la visualizzazione immunofluorescente di NET nel tessuto FFPE, abbiamo voluto ottimizzare questo protocollo per una più ampia varietà di tessuti e specie15. Inoltre, per stabilire un protocollo di immunofluorescenza ampiamente applicabile, abbiamo testato diversi protocolli modificati da studi che utilizzavano metodi di immunofluorescenza nel tessuto FFPE per rilevare i NET 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Inoltre, abbiamo provato un nuovo anticorpo H3cit per una colorazione extracellulare più specifica28. Ipotizziamo che adattando sistematicamente gli attuali protocolli di colorazione a diverse specie e tessuti, l'imaging in vitro possa essere migliorato, con conseguente migliore rappresentazione dell'interazione tra neutrofili e NET sia a livello locale che sistemico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 68672&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody&#160; 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 5103</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 25989</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 90810</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Microscopy Software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>&#160;GTX30972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 25 mg</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6335.1</td>
			<td>1:25000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCS antibody dilution 500 mL</td>
			<td>DCS diagnostics</td>
			<td>DCS AL120R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey ant goat Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit AF647</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide rack</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF 3667&#160;</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>MKP-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 37415</td>
			<td>1:2000 and 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml</td>
			<td>Maxvision</td>
			<td>MB-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCamHR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>HMT84M421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 negative control</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0931 Aglient</td>
			<td>1:50 and 1:5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-108-C&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Phosphate buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP staining jar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2292.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 219406</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 172730</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTI Histol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#160;6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Tris buffered saline (x10)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>830476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath rice cooker</td>
			<td>reishunger</td>
			<td>RCP-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet chamber</td>
			<td>Weckert Labortechnik</td>
			<td>600016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Widefield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence imaging of neutrophil extracellular traps in human and mouse tissues

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) vengono rilasciate dai neutrofili in risposta a un'infezione batterica o a un danno tissutale traumatico, ma svolgono anche un ruolo nelle malattie autoimmuni e nell'infiammazione sterile. Sono strutture simili a ragnatele composte da filamenti di DNA a doppio filamento, istoni e proteine antimicrobiche. Una volta rilasciati, i NET possono intrappolare e uccidere i patogeni extracellulari nel sangue e nei tessuti. Inoltre, i NET partecipano alla regolazione omeostatica stimolando l'adesione piastrinica e la coagulazione. Tuttavia, la produzione disregolata di NET è stata anche associata a varie malattie, tra cui la sepsi o le malattie autoimmuni, il che li rende un bersaglio promettente per l'intervento terapeutico. Oltre alla microscopia elettronica, la visualizzazione dei NET mediante imaging a immunofluorescenza è attualmente uno dei pochi metodi noti per dimostrare le interazioni NET nei tessuti. Pertanto, sono stati utilizzati vari metodi di colorazione per visualizzare i NET. In letteratura, sono descritti diversi protocolli di colorazione e sono stati identificati quattro componenti chiave che mostrano un'elevata variabilità tra i protocolli: (1) i tipi di anticorpi utilizzati, (2) l'uso di agenti autoriducenti l'autofluorescenza, (3) i metodi di recupero dell'antigene e (4) la permeabilizzazione. Pertanto, i protocolli di colorazione in immunofluorescenza in vitro sono stati sistematicamente adattati e migliorati in questo lavoro per renderli applicabili a diverse specie (topo, uomo) e tessuti (pelle, intestino, polmone, fegato, cuore, disco spinale). Dopo la fissazione e l'inclusione in paraffina, sezioni spesse 3 μm sono state montate su vetrini. Questi campioni sono stati colorati con anticorpi primari per la mieloperossidasi (MPO), l'istone citrullinato H3 (H3cit) e l'elastasi neutrofila (NE) secondo un protocollo di colorazione modificato. I vetrini sono stati colorati con anticorpi secondari ed esaminati utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ampio campo. I risultati sono stati analizzati secondo una scheda di valutazione e le differenze sono state registrate in modo semi-quantitativo.
Qui presentiamo un protocollo di colorazione NET ottimizzato adatto a diversi tessuti. Abbiamo utilizzato un nuovo anticorpo primario per colorare H3cit e ridotto la colorazione non specifica con un agente autofluorescente. Inoltre, abbiamo dimostrato che la colorazione NET richiede una temperatura elevata costante e un'attenta manipolazione dei campioni.

Neutrophil extracellular traps (NETs) were first visualized by Brinkmann et al. as a pathway of cellular death different from apoptosis and necrosis in 20041. In this pathway, neutrophils release their decondensed chromatin into the extracellular space to form large web-like structures covered in antimicrobial proteins that were formerly stored in the granules or cytosol. These antimicrobial proteins include neutrophil elastase (NE), myeloperoxidase (MPO), and citrullinated histone H3 (H3cit), which are commonly used for indirect immunofluorescence detection of NETs2. This method not only identifies the quantitative presence of these proteins; indeed, it has the advantage of specifically detecting NET-like structures. In the NETs, the mentioned proteins co-localize with extracellular DNA, which can be detected by an overlap of the fluorescence signals of each stained protein and the extracellular DNA. In contrast to the overlapping signals due to extracellular DNA and protein co-localization in NETs, intact neutrophils show no co-localization. Here, the NET components are usually stored separately in the granules, nuclei, and cytosol3.
Since their first discovery, it has been shown that NETs play a central role in numerous diseases, particularly those involving inflammation. NETs show antimicrobial functions during infection through trapping and killing extracellular pathogens in blood and tissue4,5. However, NETs have also been connected to autoimmune diseases and hyperinflammatory responses, like systemic lupus erythematosus, rheumatic arthritis, and allergic asthma6,7,8. NETs promote vaso-occlusion and inflammation in atherosclerosis, platelet adhesion, and are speculated to play a role in metastatic cancer9,10,11. Nevertheless, they are thought to have anti-inflammatory properties by reducing proinflammatory cytokine levels12. While NETs are gaining more interest in a broader field of research, a robust NET detection method is fundamental for future research.
Even though the visualization of NETs in different tissue using immunofluorescence imaging is complex and requires customization, apart from electron microscopy, it is currently one of the most renowned methods for visualizing the interactions between NETs and cells and is predominantly used in formalin-fixed paraffin-embedded tissues (FFPE)13,14. However, comparing NET imaging is difficult, as different laboratories use their own customized protocols. These protocols differ in their use of antibodies, antigen retrieval, or permeabilization method and are often optimized for a specific type of tissue3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.
After Brinkmann et al. published the first methodic study using immunofluorescent visualization of NETs in FFPE tissue, we wanted to optimize this protocol for a wider variety of tissues and species15. Additionally, to establish a broadly applicable immunofluorescence protocol, we tested different modified protocols from studies that used immunofluorescence methods in FFPE tissue to detect NETs3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Furthermore, we tried a new H3cit antibody for more specific extracellular staining28. We hypothesize that by systematically adapting current staining protocols to different species and tissue, in vitro imaging can be improved, resulting in a better representation of the interaction between neutrophils and NETs both locally and systemically.

Autore in primo piano: Imaging di trappole extracellulari neutrofile in tessuti umani e di topo 

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Prima di iniziare l'ottimizzazione del protocollo, abbiamo identificato i passaggi chiave per una colorazione di successo cercando su PubMed gli studi che utilizzavano il tessuto FFPE per l'immunocolorazione dei NET e confrontando i loro protocolli. Le differenze di protocollo più promettenti sono state identificate come i passaggi chiave per l'ottimizzazione del protocollo, mentre i passaggi che per lo più corrispondevano tra loro non sono stati modificati (Tabella 1).
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Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono associate a varie malattie e l'immunofluorescenza viene spesso utilizzata per la loro visualizzazione. Tuttavia, esistono vari protocolli di colorazione e, in molti casi, viene esaminato un solo tipo di tessuto. Qui, stabiliamo un protocollo generalmente applicabile per la colorazione dei NET nel topo e nel tessuto umano.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

Tra la selezione degli anticorpi per l'imaging tissutale, il processo di fissazione rappresenta una sfida per il mascheramento dell'epitopo. Pertanto, è necessario un passaggio di recupero personalizzato per esporre questi antigeni per il legame degli anticorpi. Inoltre, l'autofluorescenza intrinseca ai tessuti può causare difficoltà fino a un'elevata colorazione di fondo.Tuttavia, l'uso di approcci diversi nei protocolli in letteratura ostacola un confronto standardizzato tra le immagini. Il nostro studio mira a soddisfare la domanda di procedure standardizzate e ad assistere il ricercatore nel superare le sfide durante il processo di imaging. Abbiamo stabilito un protocollo di imaging versatile applicabile a diversi tessuti confrontando vari protocolli diversi.Quindi il nostro lavoro fornisce suggerimenti per la guida e la risoluzione dei problemi, dall'uso degli anticorpi al montaggio del campione, evidenziando le potenziali insidie. I nostri risultati fanno progredire la ricerca introducendo un nuovo anticorpo primario per il citrullinato hisone tre e un agente riducente autofluorescente per ridurre al minimo la colorazione di fondo. Inoltre, per un imaging di successo, sottolineiamo l'attenta manipolazione dei campioni e l'importanza di mantenere una temperatura elevata costante per il recupero dell'antigene.

immunofluorescence-imaging-neutrophil-extracellular-traps-human-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

4.4K Views.  University of Hamburg. Tra la selezione degli anticorpi per l'imaging tissutale, il processo di fissazione rappresenta una sfida per il mascheramento dell'epitopo. Pertanto, è necessario un passaggio di recupero personalizzato per esporre questi antigeni per il legame degli anticorpi. Inoltre, l'autofluorescenza intrinseca ai tessuti può causare difficoltà fino a un'elevata colorazione di fondo.Tuttavia, l'uso di approcci diversi nei protocolli in letteratura ostacola un confronto standardizzato tra le im...

Video: Autore in primo piano: Imaging di trappole extracellulari neutrofile in tessuti umani e di topo 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.