يحب المؤلفون الاعتراف بمساهمات الدكتور سيزار راميريز خلال تطورات الطريقة الأولية. تم تمويل هذا البحث من خلال منح NIAID R21AI167849 إلى FGN ، المشروع 22-21244S من مؤسسة العلوم التشيكية ، جمهورية التشيك إلى MN.

فحص الهياكل الدهنية باستخدام وسم النظائر المستقرة

<ol>
	<li>Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotopically+labeled+internal+standards+in+quantitative+bioanalysis+using+liquid+chromatography/mass+spectrometry:+Necessity+or+not.">Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).</li><li>Tose, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+stable+isotope+labeling+and+liquid+chromatography-trapped+ion+mobility+spectrometry-time-of-flight-tandem+mass+spectrometry+for+de+novo+mosquito+ovarian+lipid+studies.">Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies.</a> Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).</li><li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics.">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).</li><li>Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+enhances+low-abundance+species+detection+in+untargeted+lipidomics.">Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics.</a> Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+parallel+accumulation-serial+fragmentation+(PASEF)+with+a+novel+trapped+ion+mobility+mass+spectrometer.">Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li><li>Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometric+approaches:+DIA,+WiSIM-DIA,+and+untargeted+DIA.">Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA.</a> Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+identification+strategy+on+the+reproducibility+of+the+DDA+and+DIA+results.">Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results.</a> J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).</li><li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+data+acquisition+and+processing+strategies+with+increased+throughput+and+selectivity:+PSMART+analysis+for+global+qualitative+and+quantitative+analysis.">Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).</li><li>Tsou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIA-umpire:+Comprehensive+computational+framework+for+data-independent+acquisition+proteomics.">DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics.</a> Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).</li><li>Triebl, A., Wenk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+considerations+of+stable+isotope+labelling+in+lipidomics.">Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics.</a> Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).</li></ol>

ماثيو ويليتس وملفين أ. بارك موظفان في شركة Bruker Daltonics Inc ، الشركة المصنعة للأداة التجارية timsTOF. يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصلحة مالية متنافسة.

عند تقييم استخدام هذا البروتوكول ، من الضروري التأكد من أن معلمات DIA-PASEF و MS / MS قابلة للتطبيق على الدهون الثلاثية المعنية. على وجه التحديد ، يجب أن تتبع نوافذ التنقل وعرض النافذة نمط الدهون الثلاثية. يمكن تحديد ذلك من خلال تشغيل سابق باستخدام طريقة DDA. عند تتبع الدهون الثلاثية في المعيار الد?...

عند تحليل بيانات الدهون ، يعد وضع العلامات على النظائر المستقرة (SIL) طريقة فعالة لتقييم المسارات الأيضية في الكائنات الحية. في هذه الطريقة، تستبدل الذرات الموجودة داخل المادة المراد تحليلها بنظائر مستقرة تحتوي على 13C أو 2H. يتم دمج هذه النظائر بشكل أكبر في السلائف ، والتي يتم تضمينها لاحقا داخل الأحماض الدهنية ، مع تسمية المناطق التي توجد فيها. باستخدام هذه النظائر ، يمكن للمرء تحديد توزيع الدهون واستقلابها ، لأنها ستتناقض مع الخلفية غير المسماة1. منصات قياس الطيف الكتلي الشائعة غير قادرة على تمييز الإشارة القادمة من الجزيئات الداخلية2. يتطلب نجاح SIL استخدام أدوات تحليلية فائقة الدقة. يسمح الكروماتوغرافيا السائلة المقترنة بمطياف الحركة الأيونية المحاصرة عالية الدقة والتراكم المتوازي والتجزئة المتسلسلة ووقت الطيران (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS / MS) بفصل الأنواع الموسومة وغير الموسومة2. تتمثل ميزة تحليل LC-TIMS-PASEF-TOF-MS / MS في أنه يمكن ترشيح إشارة MS من خلال وقت الاحتفاظ (RT) والتنقل ، وبالتالي تقليل التداخلات المحتملة للجزيئات الداخلية ، وكذلك القياس الكمي وفصل جميع الأنواعالمرغوبة 2. في TIMS ، يتم تثبيت الأيون أولا مقابل طور متنقل للغاز ثم يتم إطلاقه لاحقا وفقا لحركته. يوفر هذا مخططات نقل عالية الدقة أثناء التشغيل بجهد أقل من أجهزة IMSالسابقة 3. Mobilograms عبارة عن مخططات كتلية للشحن مقابل وقت الانجراف يمكن استخدامها للتمييز بين المركبات بناء على وقت الانجراف ومقدار التداخل4.
باستخدام تقنية PASEF إضافية ، تزداد سرعة التسلسل بشكل كبير دون التضحية بالحساسية5. تتضمن نظرية PASEF تراكم الأيونات متبوعة بإطلاقها المتسلسل بترتيب حركتها. يتم ذلك عن طريق تراكم الأيونات في محاذاة متوازية لحركتها. التراكم بهذه الطريقة يمنع فقدان الأيونات. علاوة على ذلك ، يحدث اختيار أيون السلائف في وقت واحد مع تراكم الأيونات وإطلاقها. وبهذه الطريقة، تختار PASEF سلائف متعددة على التوالي خلال كل مسح TIMS، بدلا من السلائف الفردية لكل مسح نموذجي لأداة TIMS التي لا تستخدم PASEF. عندما تتراكم أيونات السلائف بشكل متزامن وتطلق في قمم 2 مللي ثانية ضمن مسح TIMS يبلغ حوالي 100 مللي ثانية لكل إطار ، يتم تضخيم الإشارة بأكثر من ترتيب واحد من حيث الحجم ، وبالتالي زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء3. وتؤدي إضافة نظام PASEF إلى نظام TIMS إلى زيادة كفاءة نظام إدارة السلامة/الإدارة. وبما أن نظام TIMS-PASEF مقترن بنظام MS/MS ، فمن الممكن إجراء تجزئة أكثر كفاءة. وخلافا للكشف التقليدي عن MS/MS، تضغط إشارة السلائف من TIMS-PASEF، وتكتشف أيونات الشظايا في وقت واحد مع وقت الشطف TIMS وموضع الحركة الأيونية للسلائف3.
عند الحصول على البيانات من مطياف الكتلة ، هناك خيارات في وضع المسح المطلوب. يحدد الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) أيونات السلائف من فحص MS1 بناء على وفرتها ، قبل تجزئتها وإجراء فحص MS2. يعمل وضع المسح هذا على تجزئة أكبر عدد ممكن من السلائف. نهج DDA مستهدف ، وستعتمد النتائج على اختيار الأيونات3. ومع ذلك ، غالبا ما يواجه DDA-PASEF مشاكل في قابلية التكرار بين النسخ المتماثلة. في حين أن DDA هي أداة رائعة في التحليل المركز ، فإن المخاليط المعقدة تواجه صعوبة أكبر في الحصول على بياناتها6. وذلك لأنه يمكن مراقبة كمية صغيرة فقط من الأيونات في وقت واحد3. الحصول على البيانات المستقلة (DIA) هو طريقة يتم فيها تجزئة النوافذ المحددة مسبقا من m / z بشكل مستقل عن شدتها ، ويتم مسحها جميعا ضمن النطاق7. باستخدام وضع المسح هذا ، تنتقل السحب الأيونية بأكملها من IMS إلى مطياف الكتلة3. في دراسات البروتينات ، ينتج عن هذا كميات أكبر من البروتينات التي يتم قياسها كميا في فترة زمنية أقصر مقارنة ب DDA. بالإضافة إلى ذلك ، يفتقد DIA عددا أقل من قيم m / z مقارنة ب DDA. لذلك ، أظهر هذا البديل تحسينات كبيرة في استنساخ البيانات في نسبة الإشارة إلى الضوضاء والقياس الكمي بشكل أفضل من DDA. في هذا العمل الحالي ، هدفنا هو تنفيذ DIA بالطريقة التي أبلغ عنها Tose et al.2. قمنا بتحسين قابلية استنساخ الإشارات وشدتها ، مما أسفر عن معلومات أكثر وأكثر حسما حول تعبئة دهون SIL وتوزيعها واستقلابها في العينات البيولوجية مستفيدين من اكتساب DDA و DIA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accucore C30 colum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27826-252130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Compass Data Analysis</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>2363525870</td>
			<td>Version 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose-13C6</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EquiSplash Lipidomix</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330731-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-417-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heavy water (2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>1.13366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene pestles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BAF199230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>L20234651907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silanized glass inserts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-251-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose-13C12</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>605417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>timsTOF</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>1.84443E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuning Mix Calibration Standard</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>36</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing de novo lipids using stable isotope labeling lc-tims-tof ms/ms

الليبيدات شديدة التنوع ، ويمكن أن يكون للتغيرات الصغيرة في هياكل الدهون وتكوينها تأثيرات عميقة على الوظائف البيولوجية الحرجة. يوفر وضع العلامات على النظائر المستقرة (SIL) العديد من المزايا لدراسة توزيع الدهون وتعبئتها واستقلابها ، بالإضافة إلى تخليق الدهون من جديد . يتطلب التنفيذ الناجح لتقنية SIL إزالة التداخلات من الجزيئات الداخلية. في العمل الحالي ، نصف بروتوكولا تحليليا عالي الإنتاجية لفحص دهون SIL من العينات البيولوجية. سيتم عرض أمثلة على تحديد الدهون دي نوفو أثناء تطور مبيض البعوض. يسمح استخدام الكروماتوغرافيا السائلة التكميلية لقياس مطياف الحركة الأيونية المحاصرة وقياس الطيف الكتلي بالفصل وتخصيص الدهون من عينة واحدة في مسح واحد (<1 ساعة). يستفيد النهج الموصوف من التطورات الأخيرة في الاستحواذ المعتمد على البيانات والاكتساب المستقل للبيانات ، باستخدام التراكم المتوازي في فخ التنقل متبوعا بالتجزؤ المتسلسل والتفكك الناجم عن الاصطدام. يكشف قياس SIL على مستوى سلسلة الأحماض الدهنية عن تغيرات في ديناميكيات الدهون أثناء تطور المبيض للبعوض. يتم تعيين هياكل الدهون الجديدة بثقة بناء على وقت الاحتفاظ بها وحركتها ونمط تجزئتها.

When analyzing lipid data, stable isotope labeling (SIL) is an effective method to assess metabolic pathways in living organisms. In this method, atoms within an analyte are replaced by stable isotopes containing 13C or 2H. These isotopes are further incorporated into precursors, which are later embedded within the fatty acids, labeling the areas in which they reside. With these isotopes, one is able to identify the distribution and metabolism of lipids, as they will contrast against the unlabeled background1. Common mass spectrometry platforms are not able to distinguish the signal coming from endogenous molecules2. The success of SIL requires the use of ultrahigh-resolution analytical tools. Liquid chromatography coupled to high-resolution trapped ion mobility spectrometry-parallel accumulation sequential fragmentation-time-of-flight tandem mass spectrometry (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) allows the separation of labeled and nonlabelled species2. The advantage of LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analysis is that the MS signal can be filtered by the retention time (RT) and mobility, thus reducing potential interferences of endogenous molecules, as well as quantification and separation of all desired species2. In TIMS, an ion is first held stationary against a gas-mobile phase and subsequently released according to its mobility. This provides high-resolution mobilograms while operating at a lower voltage than earlier IMS instrumentation3. Mobilograms are plots of mass to charge versus drift time that can be used to distinguish between compounds based off of their drift time and amount of overlap4.
By using an additional PASEF technique, sequencing speed is greatly increased without sacrificing sensitivity5. The PASEF theory involves the accumulation of ions followed by their sequential release in the order of their mobility. This is done by accumulating ions in parallel alignment to their mobility. The accumulation in this fashion prevents ion loss. Furthermore, the precursor ion selection occurs simultaneously with the accumulation and release of the ions. With this method, PASEF selects multiple precursors in series during each TIMS scan, rather than the individual precursors per scan typical of a TIMS instrument that does not use PASEF. When the precursor ions are concurrently accumulated and released in 2 ms peaks within a TIMS scan of approximately 100 ms per frame, the signal is amplified by over one order of magnitude, therefore increasing the signal-to-noise ratio3. The PASEF addition to the TIMS increases the efficiency of the MS/MS. As the TIMS-PASEF is coupled with MS/MS, a more efficient fragmentation is possible. Unlike conventional MS/MS detection, the precursor signal is compressed from the TIMS-PASEF, and the fragment ions are detected simultaneously to the TIMS elution time and ion mobility position of the precursor3.
When acquiring data from a mass spectrometer, there are options in the scan mode desired. Data dependent acquisition (DDA) selects precursor ions from the MS1 scan based on their abundances, before fragmenting them and performing the MS2 scan. This scan mode fragments as many precursors as possible. The DDA approach is targeted, and results will depend on the ion selection3. However, DDA-PASEF often has problems in the reproducibility between replicates. While DDA is a great tool in a focused analysis, complex mixtures have greater difficulty in their data acquisition6. This is because only a small amount of ions can be monitored simultaneously3. Data independent acquisition (DIA) is a method where preselected windows of m/z are fragmented independently from their intensity, and all are scanned within the range7. With this scan mode, entire ion clouds are transmitted from the IMS to the mass spectrometer3. In proteomics studies this results in greater amounts of proteins being quantified in a shorter time span compared to DDA. In addition, DIA misses fewer m/z values compared to DDA. Therefore, this alternative has shown great improvements in data reproducibility in signal to noise ratio and better quantification than DDA. In this present work, our goal is to implement DIA to the method reported by Tose et al.2. We improved the reproducibility and intensity of signals, yielding further and more conclusive information on SIL lipids mobilization, distribution and metabolism in biological samples taking advantage of DDA and DIA acquisition.

تسليط الضوء على المؤلف: القياس الكمي للعينات الدهنية المعقدة باستخدام وسم النظائر المستقرة

تتبع الدهون الجديدة باستخدام وسم النظائر المستقرة LC-TIMS-TOF MS / MS

This research intends to implement more specific quantification in lipidomic samples using stable isotope labeling. This allows us to understand lipid panels and highly diverse samples from insects to humans. There currently is a gap in this field regarding the standardization of LC, TIMS, Top, MS/MS in lipidomic investigations.Here we provide a method for tracking biomass remains for this purpose. In the future, our research will involve the investigation of epigenetics and metabolomics present in the biological process using the LC team staff, MS/MS, involve DDA and DIA methods.

يسهل وضع العلامات على النظائر المستقرة تصور الدهون الثلاثية في دراسات ديناميات الدهون لمبيض البعوض الأنثوي. في مجال التنقل ثنائي الأبعاد ، يتم عرض الدهون الثلاثية 48: 1 في منطقة ذات وقت احتفاظ محدد فيما يتعلق بالتنقل 1 / K0. يمكن تصور شدة الدهون الثلاثية بخط أزرق أغمق. تمثل البقع الأخرى ?...

تظهر هنا طريقة لفحص التراكيب الليبيدة من خلال وضع العلامات على النظائر المستقرة باستخدام وقت الاحتفاظ بها وحركتها وتجزئتها.

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

يهدف هذا البحث إلى تنفيذ تقدير كمي أكثر تحديدا في العينات الدهنية باستخدام وسم النظائر المستقرة. هذا يسمح لنا بفهم الألواح الدهنية والعينات المتنوعة للغاية من الحشرات إلى البشر. توجد حاليا فجوة في هذا المجال فيما يتعلق بتوحيد LC و TIMS و Top و MS / MS في التحقيقات الدهنية.نقدم هنا طريقة لتتبع بقايا الكتلة الحيوية لهذا الغرض. في المستقبل ، سيشمل بحثنا التحقيق في علم التخلق والأيض الموجود في العملية البيولوجية باستخدام طاقم فريق LC ، MS / MS ، بما في ذلك طرق DDA و DIA.

tracing-de-novo-lipids-using-stable-isotope-labeling-lc-tims-tof-msms

Research

JoVE Journal

Chemistry

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

749 Views.  Florida International University. يهدف هذا البحث إلى تنفيذ تقدير كمي أكثر تحديدا في العينات الدهنية باستخدام وسم النظائر المستقرة. هذا يسمح لنا بفهم الألواح الدهنية والعينات المتنوعة للغاية من الحشرات إلى البشر. توجد حاليا فجوة في هذا المجال فيما يتعلق بتوحيد LC و TIMS و Top و MS / MS في التحقيقات الدهنية.نقدم ?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: القياس الكمي للعينات الدهنية المعقدة باستخدام وسم النظائر المستقرة

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable isotope labeling (SIL) offers several advantages for the study of lipid distribution, mobilization, and metabolism, as well as de novo lipid synthesis. The successful implementation of the SIL technique requires the removal of interferences from endogenous molecules. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of SIL lipids from biological samples; examples will be shown of lipid de novo identification during mosquito ovary development. The use of complementary liquid chromatography trapped ion mobility spectrometry and mass spectrometry allows for the separation and lipids assignment from a single sample in a single scan (&lt;1 h). The described approach takes advantage of recent developments in data-dependent acquisition and data-independent acquisition, using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. The measurement of SIL at the fatty acid chain level reveals changes in lipid dynamics during the ovary development of mosquitoes. The lipids de novo structures are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

Presented here is a method for screening lipid structures through stable isotope labeling by using their retention time, mobility, and fragmentation.

Calibration of the Mass Spectrometer for Screening Lipids with Stable Isotope Labeling by LC-TIMS-TOF MS/MS

To begin the mass spectrometer, or MS calibration for LC-TIMS-TOF-MS/MS, open the TIMS control software, and under the calibration sub-tab, click on m/z, select tuning mix from the Dropbox, and click calibrate at the bottom right corner. Continue to click calibrate until a score of 100%is achieved. Now select the mobility tab, and follow the same steps as demonstrated until the 100%calibration score is reached.To generate each calibration point in the calibration curve, spike the lipid internal standard mixture with 10 microliters of deuterated internal standard mixture. Prepare seven such spiked samples for seven calibration points in the desired range. Using the data analysis software, manually annotate the fatty acid chains based on the passive MS/MS patterns.To determine the stable isotope labeling, or SIL efficiency, calculate the ratio of the area of the SIL-containing isotopes to the area of the non-SIL-containing isotopes. Calculate the theoretical pattern by determining the probability of finding a labeled atom at any site. Calculate SIL enrichment by fitting the experimental isotope profiles with the theoretical pattern simulated on data analysis software.To start the run, activate the column oven by clicking the thermometer button, and activate the pumps by clicking the valve button. Set the MS method to the appropriate method saved earlier. Verify that the injection volume is five microliters, and line one target's vial 20 to one, and save the sample list.Start the sequence, and confirm successful injection by the message stating injected, displayed on the system. Copy line one, and paste it below to generate a new line two. Populate line two with samples depending on the experiment.Ensure that the correct position in the autosampler is used. If the mobile phases are fresh, first perform a peak shape test with the lipid mixture standards from the manufacturer, to compare it with previous results. The lipid mixture and the standards are displayed on the screen.Make sure new lines have the correct separation method, and not the preconditioning method used in line one. Ensure that MS method entered is correct. Check that the correct processing method is loaded, and the run automated process is enabled.Save the sample list to ensure samples are analyzed after the current run finishes.

معايرة مطياف الكتلة لفحص الدهون مع وسم النظائر المستقرة بواسطة LC-TIMS-TOF MS / MS

LC-TIMS-TOF MS/MS Data Analysis for Screening Lipids with Stable Isotope Labeling

To begin, open the data analysis software. At the top left corner, click on the file button and select open. To select the files of choice, right click on the file name and select properties.Then select calibration status. At the dropdown box, select internal calibration for the mass spectrometer. Ensure that all errors are less than one parts per million.After that, select internal mobility calibration and confirm that the error is less than one part per million. Next, right click on chromatogram and select edit chromatogram. At type, click the dropdown box and select extracted ion chromatogram.Under filter, select all MS, and for scan mode, select all to view the peaks for the molecule of interest rather than only its fragments. There are two filter options for molecule selection, masses or formula. If masses is selected, choose the theoretical M over Z of the molecule of interest, which in this case is 829.7985.If formula is selected, choose the formula for the molecule and the ion forms of interest, which in this case is ammonium. For width, select plus or minus one. For polarity, ensure that it maintains the positive mode.Under mobility, select 1.455 to 1.465 to isolate the molecule of interest and filter out molecules not falling within these values. Once the parameters are selected, click change followed by okay at the top right. After a brief time, the software will process the selections and output a chromatogram.Right click at the baseline of the origin of the peak of interest and drag while holding to the end of the peak to obtain a live mass spectrum of fragments within that retention time. Right click at the left of the screen on mobilogram and select edit mobilogram. A window named edit mobilogram traces will appear.Follow the steps demonstrated previously. For retention time, input the retention time of the peak of interest. Once the parameters are selected, click add, and okay at the top right.Wait till the software processes the selections and outputs a chromatogram. For extracting ions, repeat the steps demonstrated previously until a list of ions is formed. At the bottom of the MS window, select profile MS and fragment MS to allow a spectrum view of ions from a full scan and passive.For the spectrum view, right click and select copy compound spectra. The spectrum data that appears at the right can provide more information on the compound, such as resolution resolving power, intensity, and signal-to-noise ratio. To process the data, manually integrate the chromatogram and mobility peaks to yield valuable information on the molecule of interest.Right click find and select compounds manually chromatogram or mobilogram. Left click and highlight the desired peak. The obtained information includes retention time, area, signal-to-noise ratio, and mobility.