Gli autori apprezzano i contributi del Dr. Cesar Ramirez durante gli sviluppi iniziali del metodo. Questa ricerca è stata finanziata dalle sovvenzioni NIAID R21AI167849 a FGN, progetto 22-21244S dalla Czech Science Foundation, Repubblica Ceca a MN.

1. Preparazione del campione
<ol><li>Dissezione degli insetti<ol><li>Sezionare le ovaie di zanzara Aedes aegypti quando hanno 7 giorni di vita in una soluzione salina tamponata con fosfato utilizzando microaghi.</li>
		<li>Raccogliere otto ovaie da una soluzione salina tamponata con fosfato utilizzando microaghi e conservare in provette da microcentrifuga da 1,5 ml a -80 °C.</li>
		<li>Raccogliere le ovaie in repliche biologiche.</li>
	</ol></li>
	<li>Estrazione dei lipidi<ol><li>Aggiungere 10 μL di standard interno (ISTD) nelle otto ovaie raccolte in una concentrazione di 1 ppm. L'ISTD è una miscela lipidica marcata con sette deuterio di 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina-D7 (15:15:15 0-18:1 (D7) PC), lisofosfatidilcolina-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadecanoil-2-ottadecenoil-glicero-3-fosfoetanolammina-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoil-2-idrossi-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoinositolo-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadecanoil-3-ottadecenoil-sn-glicerolo (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadecanoil-2-ottadecenoil)-sn-glicerolo-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-ottadecenoil-sn-glicerolo-D7 (18:1 MAG (D7)), colesterolo oleato-D7 [18:1 (D7) estere di colesterolo).</li>
		<li>Attendere che si asciughi a temperatura ambiente. Aggiungere 100 μl di butanolo/metanolo e 3 μl di butilidrossitoluene. Omogeneizzare manualmente per 10 s con pestelli in polipropilene da 1,5 mL.</li>
		<li>Sciacquare il pestello con 200 μL di butanolo/metanolo e unirlo alla soluzione omogeneizzata.</li>
		<li>Sonicare la provetta della microcentrifuga a temperatura ambiente e potenza media per 30 minuti.</li>
		<li>Provette da centrifuga a 1600 x g per 10 min a 20 °C. Trasferire il surnatante in una fiala dell'autocampionatore con 300 μl di inserti in vetro silanizzato.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Configurazione dello strumento
<ol><li>Preparazione della fase mobile<ol><li>Preparare la fase mobile con una composizione di 30:40:30 (fase mobile A) e 10:5:85 (fase mobile B) utilizzando acetonitrile, acqua e isopropanolo come rispettiva proporzione. In entrambe le fasi mobili, aggiungere 10 mmol/L di formiato di ammonio in acqua e lo 0,1% di acido formico per creare una condizione tampone.</li>
		<li>Pesare 3,15 g di formiato di ammonio in 10 ml di acqua. Aggiungere 500 μL di questa soluzione in 12,5 mL di acqua. In sequenza, mettere in un matraccio tarato da 250 mL e riempire con isopropanolo fino a circa 2/3 del pallone. Mescolare roteando.</li>
		<li>Aggiungere 250 μL di acido formico (85%), riempire con 25 mL di acetonitrile e isopropanolo alla linea di riempimento di 250 mL e mescolare.</li>
	</ol></li>
	<li>Nel sistema MS, sul lato sinistro dello schermo con le impostazioni MS, determinare l'intervallo di massa selezionando 50 come impostazione minima e 1850 come impostazione di scansione massima.<ol><li>Selezionare Polarità come modalità ioni positivi. Selezionare la modalità di scansione come DIA-PASEF. A tale scopo, selezionare Ottimizza e apri metodo di analisi da un metodo DDA precedente con i seguenti parametri LC.<ol><li>Per la separazione del gradiente: Iniezione del campione: 0% B, tempo di mantenimento 1 min. Aumentare al 55% B, tenere premuto fino a 6,4 min. Aumentare al 65% B, tenere premuto fino a 24 min. Aumentare a 88% B, tenere premuto fino a 40,8 min. Aumentare al 95% B, tenere premuto fino a 48,1 min. Diminuire al 35% B, tenere premuto fino a 56 min. Diminuire a 0% B, tenere premuto fino a 60 min.</li>
			<li>Per le condizioni HPLC: Volume di iniezione: 5 μl Velocità del solvente: 0,25 mL/min Tempo di esecuzione totale: 60 min, di cui 5 min servono a precondizionare la colonna.</li>
			<li>Preparare il cromatografo liquido inserendo la colonna nel cromatografo liquido. Eseguire un pezzo grezzo per pulire la colonna e verificare la presenza di perdite. Questo può essere visto nello strumento che non mantiene la pressione o il flusso.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Per creare un nuovo metodo, eseguire i passaggi descritti di seguito (Figura 1 e Figura 2).<ol><li>Apri il software e fai clic su Connetti tutti gli strumenti. Se la connessione ha esito positivo, il sistema LC emette un segnale acustico e la schermata di controllo elenca HyStar nella casella Stato senza alcun messaggio di errore.</li>
		<li>Fare clic sulla scheda Acquisizione . Nel Navigatore tabelle di esempio, individuare il menu a discesa dei tag e selezionare un metodo precedente.</li>
		<li>Raddoppia l'ultima tabella di esempio. Fare clic su Salva con nome... e salvare la nuova lista di campioni con il formato: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) dove (XXXX) è un breve descrittore dell'analisi.</li>
		<li>Fare clic con il pulsante destro del mouse sul metodo di separazione e fare clic su Modifica metodo. Fare clic su Modifica metodo modulo.</li>
		<li>Fare clic su Download. In caso di esito positivo, verrà visualizzato il download riuscito. Metodo di chiusura dello schermo senza salvataggio.</li>
		<li>In Impostazioni MS vai alle impostazioni TIMS, seleziona l'inizio 1/k0 a 0,70 e 1/k0 termina a 1,85. Impostare il tempo di rampa su 150 ms. In questo modo, il ciclo di lavoro e la velocità di rampa vengono regolati automaticamente.</li>
		<li>Nella finestra inferiore, seleziona la scheda Origine . Selezionare il tipo di sorgente come ESI e impostare l'offset della piastra terminale su 800 V e il capillare su 4500 V. Controllare la scatola del nebulizzatore e impostare la pressione su 4,0 bar. Impostare il gas secco a 4,0 L/min e la temperatura secca a 250 °C.</li>
		<li>A destra della scheda sorgente, selezionare la scheda Sintonizzazione. Fare clic sulla scheda Sottoscheda Generale e sotto l'intestazione di trasferimento assicurarsi dei seguenti parametri: Deflessione 1 triangolo: 70 V Imbuto 1 RF: 250 vpp Energia isCID: 0 eV Imbuto 2 RF: 250 vpp RF multipolare: 500 vpp.<ol><li>Sotto l'intestazione della cella di collisione, assicurati che i seguenti parametri siano i seguenti: Energia di collisione: 6,0 eV Collisione RF: 1200 vpp.</li>
			<li>Sotto la voce quadrupolo assicurarsi che i seguenti parametri siano i seguenti: Energia ionica: 6 eV Massa ridotta: 250 m/z.</li>
			<li>Nella scheda pre-TOF a fuoco assicurarsi che i seguenti parametri siano rispettati: Tempo di trasferimento: 45 μs Memorizzazione pre-impulso: 5,0 μs.</li>
		</ol></li>
		<li>Fare clic sulla sottoscheda Elaborazione . Il rilevamento dei picchi sotto gli spettri di massa garantisce i seguenti parametri: Soglia assoluta: 667 Soglia assoluta (per 100 ms AccuTime): 445.<ol><li>Il rilevamento dei picchi di mobilità inferiore garantisce i seguenti parametri: Soglia assoluta: 30,00.</li>
		</ol></li>
		<li>Fare clic sulla sottoscheda TIMS . Nella scheda Offset verificare i seguenti parametri: Δt1: -20 V Δt2: -150 V Δt3: 70 V Δt4: 150 V Δt5: 0 V Δt6: 150 V Cella di collisione: 300 V.</li>
		<li>A destra della scheda Tune, fare clic sulla scheda MS/MS . Nella scheda degli ioni precursori, assicurati che i seguenti parametri siano i seguenti: Numero di rampe PASEF: 8 Carica minima: 1 Carica massima: 1.<ol><li>Nella scheda di pianificazione, fai clic su Avanzate e assicurati che i seguenti parametri siano i seguenti: Intensità: 0,1500, 5000, 10000 Ripetizione: 1, 10, 5, 1 Soglia di intensità: 1500.</li>
			<li>Nella scheda di esclusione attiva, assicurati che i seguenti parametri siano i seguenti: Segno di spunta di esclusione attiva Rilascio dopo: 0,4 min.</li>
			<li>Nelle impostazioni di energia di collisione, assicurati che i seguenti parametri siano i seguenti: K0 (V-s/cm3): 0,70, 1,60 Energia di collisione (eV): 20.00, 35.00.</li>
			<li>Nelle impostazioni della larghezza di isolamento, assicurati che i seguenti parametri siano i seguenti: Massa (m/z): 622, 1222 Larghezza (m/z): 1,00 2,50.</li>
		</ol></li>
		<li>Configurazione DIA -PASEF: selezionare DIA-PASEF dalla modalità di scansione delle impostazioni MS a sinistra. Nella scheda MS/MS, selezionare Editor di finestre. Qui, assicurati dei seguenti parametri (Figura 3): Impostazioni finestra: Larghezza di massa: 50 Da; Sovrapposizione di massa: 0,0 Da; Calcola da poligono: passi di massa; Numero di finestre di mobilità: 1.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Calibrazione
<ol><li>Taratura dello strumento (Figura 4)<ol><li>Nella sottoscheda Calibrazione , fare clic su m/z, selezionare Tuning Mix dalla casella a discesa e fare clic su Calibra nell'angolo in basso a destra.</li>
		<li>Continuare a fare clic su Calibra fino a raggiungere un punteggio del 100%.</li>
		<li>Ora seleziona la scheda Mobilità e segui gli stessi passaggi di cui sopra fino a raggiungere il punteggio di calibrazione del 100%.</li>
	</ol></li>
	<li>Curva di calibrazione<ol><li>Miscela standard interna di lipidi spike con 10 μl di miscela standard interna deuterata. Utilizzare sette punti di calibrazione da 0,1 a 500 ng/mL di miscela standard con 10 μL di miscela standard interna deuterata.</li>
		<li>Annotare manualmente le catene degli acidi grassi in base ai modelli PASEF MS/MS già descritti in2.</li>
	</ol></li>
	<li>Efficienza dell'etichettatura SIL<ol><li>Calcolare il rapporto tra l'area degli isotopi contenenti SIL e l'area degli isotopi non contenenti SIL.</li>
		<li>Calcola il modello teorico determinando la probabilità di trovare un atomo marcato in qualsiasi sito.</li>
		<li>Calcolare l'arricchimento SIL adattando i profili isotopici sperimentali con il pattern teorico simulato su software di analisi dei dati.</li>
	</ol></li>
	<li>Avvio della corsa<ol><li>Attiva il forno a colonna facendo clic sul pulsante Termometro . Attiva le pompe facendo clic sul pulsante Valvola .</li>
		<li>Impostare il metodo MS sul metodo salvato in precedenza. Verificare che il volume di iniezione sia di 5 μl e che la linea 1 miri al flaconcino 20:1.</li>
		<li>Assicurarsi che la fiala 20:1 contenga il 50% di IPA/ACN. Salva l'elenco dei campioni.</li>
		<li>Avviare la sequenza e verificare che l'iniezione sia avvenuta correttamente (confermata da un messaggio visualizzato sul sistema che indica l'iniezione).</li>
		<li>Copia la riga 1 e incolla sotto per generare una nuova riga. Popola la linea 2 con campioni a seconda dell'esperimento corrente. Assicurarsi che venga utilizzata la posizione corretta nell'autocampionatore.</li>
		<li>Se la fase mobile è fresca, eseguire prima il test di forma del picco iniettando gli standard della miscela lipidica del produttore. Confronta con i risultati precedenti. 2 Gli standard sono una miscela lipidica di 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (15:0-18:1 PC), lisofosfatidilcolina (18:1 Lyso PC), 1-pentadecanoil-2-ottadecenoil-glicero-3-fosfoetanolammina (15:0-18:1 PE), 1-oleoil-2-idrossi-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (18:1 Lyso PE), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoinositolo (15:0-18:1 PI), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (15:0-18:1 PS), 1,2- dipentadecanoil-3-ottadecenoil-sn-glicerolo (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadecanoil-2-ottadecenoil)-sn-glicerolo (15:0-18:1 DAG), 2-ottadecenoil-sn-glicerolo (18:1 MAG), colesterolo oleato (18:1 Chol Ester).</li>
		<li>Assicurarsi che le nuove linee abbiano il metodo di separazione corretto e non il metodo di precondizionamento utilizzato nella riga 1. Assicurati che il metodo MS sia corretto (metodo del giorno corrente).</li>
		<li>Verificare che sia stato caricato il metodo di elaborazione corretto e che l'opzione Esegui processo automatizzato sia abilitata.</li>
		<li>Salvare l'elenco dei campioni per assicurarsi che i campioni vengano analizzati al termine dell'esecuzione corrente.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi dei dati
<ol><li>Software di analisi dei dati aperti (Figura 5). Nell'angolo in alto a sinistra, fai clic sul pulsante File e seleziona Apri...</li>
	<li>Seleziona i file desiderati. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome del file e selezionare Proprietà.<ol><li>Selezionare Stato calibrazione (Figura 6). Nella casella a discesa, selezionare Calibrazione iniziale per lo spettrometro di massa. Assicurarsi che tutti gli errori siano inferiori a 1 ppm.</li>
		<li>Quindi, selezionare Calibrazione iniziale della mobilità e verificare che l'errore sia inferiore a 1 ppm.</li>
		<li>Fare clic con il pulsante destro del mouse su Cromatogramma e selezionare Modifica cromatogramma (Figura 6C). In Tipo, fare clic sulla casella a discesa e selezionare Cromatogramma ionico estratto (Figura 6D). In filtro, selezionare Tutti i MS e con la modalità di scansione selezionare Tutti. Questo serve a visualizzare i picchi della molecola di interesse piuttosto che solo i suoi frammenti.<ol><li>Al di sotto di questo, ci sono due opzioni di filtro per la selezione delle molecole: Masse o Formula. Se si seleziona Masse , si può scegliere il m/z teorico delle molecole di interesse. In questo caso selezionare 829.7985 m/z. Se si seleziona Formula , è possibile scegliere la formula per la molecola e le forme ioniche di interesse per il cromatogramma. In questo caso, selezionare l'ammonio [M+NH4]. Ciò è dovuto al tampone ammonio nella fase mobile che favorirà la ionizzazione in questa forma ionica (Figura 7).</li>
			<li>Per la larghezza selezionare ±1. Per la polarità, assicurarsi che mantenga la modalità positiva. In Mobilità, selezionare 1.455-1.465. Questo viene fatto per filtrare tutte le molecole che non rientrano in questi valori e isolare la molecola di interesse.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Una volta selezionati i parametri, fai clic su Aggiungi > OK in alto a destra. Dopo un breve periodo di tempo, il software elaborerà le selezioni e produrrà un cromatogramma.</li>
	<li>Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla linea di base all'inizio del picco di interesse e trascinare tenendo premuto fino alla fine del picco. Questa integrazione manuale fornirà uno spettro di massa in tempo reale di frammenti entro quel tempo di conservazione.</li>
	<li>Mobilogramma<ol><li>Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sinistra dello schermo su Mobilogram e selezionare Modifica Mobilogram (Figura 8). Apparirà una finestra chiamata Modifica Tracce Mobilogramma. Seguire gli stessi passaggi da C.e.i.1 a C.e.i.5 (Figura 9).</li>
		<li>Al Tempo di Conservazione inserire il tempo di ritenzione del picco di interesse. In questo caso, 37,45-37,55 min.</li>
		<li>Una volta selezionati i parametri, fai clic su Aggiungi > OK in alto a destra. Dopo un breve periodo di tempo, il software elaborerà le selezioni e produrrà un cromatogramma.</li>
	</ol></li>
	<li>Per gli ioni estratti, ripetere i passaggi 4.2.3.1-4.3.2.2 fino a formare un elenco di ioni.</li>
	<li>Nella parte inferiore della finestra MS, selezionare Profilo MS e Frammento MS. Ciò consentirà una visione dello spettro degli ioni dalla scansione completa e dal PASEF.<ol><li>Nella vista spettro, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Copia spettri composti. Con i dati dello spettro che appaiono a destra, è possibile trovare ulteriori informazioni sul proprio composto come la risoluzione della risoluzione, la potenza di risoluzione, l'intensità e il rapporto segnale/rumore (S/N; Figura 10).</li>
	</ol></li>
	<li>Elaborazione<ol><li>Per elaborare i dati, integrare manualmente il cromatogramma e i picchi di mobilità per ottenere informazioni preziose sulla molecola di interesse (Figura 10).</li>
		<li>Fare clic con il pulsante destro del mouse su Trova e selezionare Integra solo cromatogramma o mobilogramma (Figura 11). Fare clic con il pulsante sinistro del mouse ed evidenziare il picco desiderato. Queste informazioni includono il tempo di conservazione, l'area, il numero di serie e la mobilità.</li>
	</ol></li>
</ol>

Screening delle strutture lipidiche mediante marcatura di isotopi stabili

<ol>
	<li>Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotopically+labeled+internal+standards+in+quantitative+bioanalysis+using+liquid+chromatography/mass+spectrometry:+Necessity+or+not.">Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).</li><li>Tose, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+stable+isotope+labeling+and+liquid+chromatography-trapped+ion+mobility+spectrometry-time-of-flight-tandem+mass+spectrometry+for+de+novo+mosquito+ovarian+lipid+studies.">Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies.</a> Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).</li><li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics.">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).</li><li>Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+enhances+low-abundance+species+detection+in+untargeted+lipidomics.">Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics.</a> Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+parallel+accumulation-serial+fragmentation+(PASEF)+with+a+novel+trapped+ion+mobility+mass+spectrometer.">Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li><li>Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometric+approaches:+DIA,+WiSIM-DIA,+and+untargeted+DIA.">Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA.</a> Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+identification+strategy+on+the+reproducibility+of+the+DDA+and+DIA+results.">Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results.</a> J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).</li><li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+data+acquisition+and+processing+strategies+with+increased+throughput+and+selectivity:+PSMART+analysis+for+global+qualitative+and+quantitative+analysis.">Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).</li><li>Tsou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIA-umpire:+Comprehensive+computational+framework+for+data-independent+acquisition+proteomics.">DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics.</a> Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).</li><li>Triebl, A., Wenk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+considerations+of+stable+isotope+labelling+in+lipidomics.">Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics.</a> Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).</li></ol>

Matthew Willetts e Melvin A. Park sono dipendenti della Bruker Daltonics Inc, il produttore dello strumento commerciale timsTOF. Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Nel valutare l'uso di questo protocollo, è essenziale assicurarsi che i parametri DIA-PASEF e MS/MS siano applicabili ai trigliceridi in questione. In particolare, le finestre di mobilità e la larghezza delle finestre dovrebbero seguire lo schema dei trigliceridi. Questo può essere determinato con un'esecuzione precedente utilizzando il metodo DDA. Quando si tracciano i trigliceridi nello standard interno, le finestre per la configurazione della DIA dovrebbero coprire tutte le molecole di interesse pre-identificate. L...

Nell'analisi dei dati lipidici, la marcatura degli isotopi stabili (SIL) è un metodo efficace per valutare le vie metaboliche negli organismi viventi. In questo metodo, gli atomi all'interno di un analita sono sostituiti da isotopi stabili contenenti 13C o 2H. Questi isotopi sono ulteriormente incorporati nei precursori, che vengono successivamente incorporati negli acidi grassi, etichettando le aree in cui risiedono. Con questi isotopi, si è in grado di identificare la distribuzione e il metabolismo dei lipidi, in quanto contrasteranno con il fondo non marcato1. Le comuni piattaforme di spettrometria di massa non sono in grado di distinguere il segnale proveniente dalle molecole endogene2. Il successo di SIL richiede l'uso di strumenti analitici ad altissima risoluzione. La cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di mobilità ionica intrappolata ad alta risoluzione-frammentazione sequenziale ad accumulo parallelo-spettrometria di massa tandem a tempo di volo (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) consente la separazione di specie marcate e non marcate2. Il vantaggio dell'analisi LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS è che il segnale MS può essere filtrato in base al tempo di ritenzione (RT) e alla mobilità, riducendo così le potenziali interferenze delle molecole endogene, nonché la quantificazione e la separazione di tutte le specie desiderate2. Nella TIMS, uno ione viene prima tenuto fermo contro una fase gas-mobile e successivamente rilasciato in base alla sua mobilità. Ciò fornisce mobilogrammi ad alta risoluzione pur operando a una tensione inferiore rispetto alla precedente strumentazione IMS3. I mobilogrammi sono grafici della massa da caricare rispetto al tempo di deriva che possono essere utilizzati per distinguere tra i composti in base al loro tempo di deriva e alla quantità di sovrapposizione4.
Utilizzando una tecnica PASEF aggiuntiva, la velocità di sequenziamento viene notevolmente aumentata senza sacrificare la sensibilità5. La teoria PASEF prevede l'accumulo di ioni seguito dal loro rilascio sequenziale nell'ordine della loro mobilità. Questo viene fatto accumulando ioni in parallelo all'allineamento della loro mobilità. L'accumulo in questo modo impedisce la perdita di ioni. Inoltre, la selezione degli ioni precursori avviene contemporaneamente all'accumulo e al rilascio degli ioni. Con questo metodo, PASEF seleziona più precursori in serie durante ogni scansione TIMS, piuttosto che i singoli precursori per scansione tipici di uno strumento TIMS che non utilizza PASEF. Quando gli ioni precursori vengono accumulati contemporaneamente e rilasciati in picchi di 2 ms all'interno di una scansione TIMS di circa 100 ms per fotogramma, il segnale viene amplificato di oltre un ordine di grandezza, aumentando così il rapporto segnale/rumore3. L'aggiunta di PASEF al TIMS aumenta l'efficienza dell'MS/MS. Poiché il TIMS-PASEF è accoppiato con MS/MS, è possibile una frammentazione più efficiente. A differenza del rilevamento MS/MS convenzionale, il segnale del precursore viene compresso dal TIMS-PASEF e gli ioni frammento vengono rilevati contemporaneamente al tempo di eluizione TIMS e alla posizione di mobilità ionica del precursore3.
Quando si acquisiscono dati da uno spettrometro di massa, ci sono opzioni nella modalità di scansione desiderata. L'acquisizione dipendente dai dati (DDA) seleziona gli ioni precursori dalla scansione MS1 in base alla loro abbondanza, prima di frammentarli ed eseguire la scansione MS2. Questa modalità di scansione frammenta il maggior numero possibile di precursori. L'approccio DDA è mirato e i risultati dipenderanno dalla selezione ionica3. Tuttavia, DDA-PASEF ha spesso problemi nella riproducibilità tra le repliche. Sebbene DDA sia un ottimo strumento in un'analisi mirata, le miscele complesse hanno maggiori difficoltà nell'acquisizione dei dati6. Questo perché solo una piccola quantità di ioni può essere monitorata contemporaneamente3. L'acquisizione indipendente dai dati (DIA) è un metodo in cui le finestre preselezionate di m/z sono frammentate indipendentemente dalla loro intensità e tutte vengono scansionate entro l'intervallo7. Con questa modalità di scansione, intere nuvole di ioni vengono trasmesse dall'IMS allo spettrometro di massa3. Negli studi di proteomica ciò si traduce in una maggiore quantità di proteine quantificate in un arco di tempo più breve rispetto alla DDA. Inoltre, la DIA perde meno valori m/z rispetto alla DDA. Pertanto, questa alternativa ha mostrato grandi miglioramenti nella riproducibilità dei dati nel rapporto segnale/rumore e una migliore quantificazione rispetto alla DDA. In questo lavoro, il nostro obiettivo è quello di implementare la DIA secondo il metodo riportato da Tose et al.2. Abbiamo migliorato la riproducibilità e l'intensità dei segnali, fornendo ulteriori e più conclusive informazioni sulla mobilizzazione, distribuzione e metabolismo dei lipidi SIL in campioni biologici sfruttando l'acquisizione di DDA e DIA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accucore C30 colum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27826-252130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Compass Data Analysis</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>2363525870</td>
			<td>Version 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose-13C6</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EquiSplash Lipidomix</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330731-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-417-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heavy water (2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>1.13366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene pestles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BAF199230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>L20234651907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silanized glass inserts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-251-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose-13C12</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>605417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>timsTOF</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>1.84443E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuning Mix Calibration Standard</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>36</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing de novo lipids using stable isotope labeling lc-tims-tof ms/ms

I lipidi sono molto diversi e piccoli cambiamenti nelle strutture e nella composizione dei lipidi possono avere effetti profondi sulle funzioni biologiche critiche. La marcatura degli isotopi stabili (SIL) offre diversi vantaggi per lo studio della distribuzione, della mobilizzazione e del metabolismo dei lipidi, nonché per la sintesi de novo dei lipidi. Il successo dell'implementazione della tecnica SIL richiede la rimozione delle interferenze dalle molecole endogene. Nel presente lavoro, descriviamo un protocollo analitico ad alto rendimento per lo screening di lipidi SIL da campioni biologici; Verranno mostrati esempi di identificazione de novo lipidica durante lo sviluppo delle ovaie delle zanzare. L'uso della cromatografia liquida complementare, della spettrometria di mobilità ionica intrappolata e della spettrometria di massa consente la separazione e l'assegnazione dei lipidi da un singolo campione in un'unica scansione (<1 ora). L'approccio descritto si avvale dei recenti sviluppi nell'acquisizione dipendente dai dati e nell'acquisizione indipendente dai dati, utilizzando l'accumulo parallelo nella trappola della mobilità seguita dalla frammentazione sequenziale e dalla dissociazione indotta dalla collisione. La misurazione del SIL a livello della catena degli acidi grassi rivela cambiamenti nella dinamica dei lipidi durante lo sviluppo ovarico delle zanzare. Le strutture dei lipidi de novo vengono assegnate con sicurezza in base al tempo di ritenzione, alla mobilità e al modello di frammentazione.

When analyzing lipid data, stable isotope labeling (SIL) is an effective method to assess metabolic pathways in living organisms. In this method, atoms within an analyte are replaced by stable isotopes containing 13C or 2H. These isotopes are further incorporated into precursors, which are later embedded within the fatty acids, labeling the areas in which they reside. With these isotopes, one is able to identify the distribution and metabolism of lipids, as they will contrast against the unlabeled background1. Common mass spectrometry platforms are not able to distinguish the signal coming from endogenous molecules2. The success of SIL requires the use of ultrahigh-resolution analytical tools. Liquid chromatography coupled to high-resolution trapped ion mobility spectrometry-parallel accumulation sequential fragmentation-time-of-flight tandem mass spectrometry (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) allows the separation of labeled and nonlabelled species2. The advantage of LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analysis is that the MS signal can be filtered by the retention time (RT) and mobility, thus reducing potential interferences of endogenous molecules, as well as quantification and separation of all desired species2. In TIMS, an ion is first held stationary against a gas-mobile phase and subsequently released according to its mobility. This provides high-resolution mobilograms while operating at a lower voltage than earlier IMS instrumentation3. Mobilograms are plots of mass to charge versus drift time that can be used to distinguish between compounds based off of their drift time and amount of overlap4.
By using an additional PASEF technique, sequencing speed is greatly increased without sacrificing sensitivity5. The PASEF theory involves the accumulation of ions followed by their sequential release in the order of their mobility. This is done by accumulating ions in parallel alignment to their mobility. The accumulation in this fashion prevents ion loss. Furthermore, the precursor ion selection occurs simultaneously with the accumulation and release of the ions. With this method, PASEF selects multiple precursors in series during each TIMS scan, rather than the individual precursors per scan typical of a TIMS instrument that does not use PASEF. When the precursor ions are concurrently accumulated and released in 2 ms peaks within a TIMS scan of approximately 100 ms per frame, the signal is amplified by over one order of magnitude, therefore increasing the signal-to-noise ratio3. The PASEF addition to the TIMS increases the efficiency of the MS/MS. As the TIMS-PASEF is coupled with MS/MS, a more efficient fragmentation is possible. Unlike conventional MS/MS detection, the precursor signal is compressed from the TIMS-PASEF, and the fragment ions are detected simultaneously to the TIMS elution time and ion mobility position of the precursor3.
When acquiring data from a mass spectrometer, there are options in the scan mode desired. Data dependent acquisition (DDA) selects precursor ions from the MS1 scan based on their abundances, before fragmenting them and performing the MS2 scan. This scan mode fragments as many precursors as possible. The DDA approach is targeted, and results will depend on the ion selection3. However, DDA-PASEF often has problems in the reproducibility between replicates. While DDA is a great tool in a focused analysis, complex mixtures have greater difficulty in their data acquisition6. This is because only a small amount of ions can be monitored simultaneously3. Data independent acquisition (DIA) is a method where preselected windows of m/z are fragmented independently from their intensity, and all are scanned within the range7. With this scan mode, entire ion clouds are transmitted from the IMS to the mass spectrometer3. In proteomics studies this results in greater amounts of proteins being quantified in a shorter time span compared to DDA. In addition, DIA misses fewer m/z values compared to DDA. Therefore, this alternative has shown great improvements in data reproducibility in signal to noise ratio and better quantification than DDA. In this present work, our goal is to implement DIA to the method reported by Tose et al.2. We improved the reproducibility and intensity of signals, yielding further and more conclusive information on SIL lipids mobilization, distribution and metabolism in biological samples taking advantage of DDA and DIA acquisition.

Autore in primo piano: Quantificazione di campioni lipidomici complessi utilizzando la marcatura di isotopi stabili

Tracciamento de novo dei lipidi mediante marcatura isotopica stabile LC-TIMS-TOF MS/MS

This research intends to implement more specific quantification in lipidomic samples using stable isotope labeling. This allows us to understand lipid panels and highly diverse samples from insects to humans. There currently is a gap in this field regarding the standardization of LC, TIMS, Top, MS/MS in lipidomic investigations.Here we provide a method for tracking biomass remains for this purpose. In the future, our research will involve the investigation of epigenetics and metabolomics present in the biological process using the LC team staff, MS/MS, involve DDA and DIA methods.

La marcatura degli isotopi stabili facilita la visualizzazione dei trigliceridi negli studi sulla dinamica dei lipidi delle ovaie delle zanzare femmine. Nel dominio della mobilità 2D, il trigliceride 48:1 viene visualizzato in una regione con un tempo di ritenzione specifico in relazione alla mobilità 1/K0. L'intensità del trigliceride può essere visualizzata da una linea blu più scura. Altre macchie rappresentano trigliceridi aggiuntivi che si trovano all'interno dell'ovaio. I tempi di ritenzione e le mo...

Qui viene presentato un metodo per lo screening delle strutture lipidiche attraverso la marcatura degli isotopi stabili utilizzando il loro tempo di ritenzione, mobilità e frammentazione.

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

Questa ricerca intende implementare una quantificazione più specifica in campioni lipidomici utilizzando la marcatura degli isotopi stabili. Questo ci permette di comprendere i pannelli lipidici e i campioni molto diversi, dagli insetti all'uomo. Attualmente esiste una lacuna in questo campo per quanto riguarda la standardizzazione di LC, TIMS, Top, MS/MS nelle indagini lipidomiche.Qui forniamo un metodo per tracciare i resti di biomassa a questo scopo. In futuro, la nostra ricerca riguarderà lo studio dell'epigenetica e della metabolomica presenti nel processo biologico utilizzando il personale del team LC, MS/MS, che coinvolge i metodi DDA e DIA.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

744 Views.  Florida International University. Questa ricerca intende implementare una quantificazione più specifica in campioni lipidomici utilizzando la marcatura degli isotopi stabili. Questo ci permette di comprendere i pannelli lipidici e i campioni molto diversi, dagli insetti all'uomo. Attualmente esiste una lacuna in questo campo per quanto riguarda la standardizzazione di LC, TIMS, Top, MS/MS nelle indagini lipidomiche.Qui forniamo un metodo per tracciare i resti di biomassa a questo scopo. In futuro, la nostra ricerca ri...

Video: Autore in primo piano: Quantificazione di campioni lipidomici complessi utilizzando la marcatura di isotopi stabili

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable isotope labeling (SIL) offers several advantages for the study of lipid distribution, mobilization, and metabolism, as well as de novo lipid synthesis. The successful implementation of the SIL technique requires the removal of interferences from endogenous molecules. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of SIL lipids from biological samples; examples will be shown of lipid de novo identification during mosquito ovary development. The use of complementary liquid chromatography trapped ion mobility spectrometry and mass spectrometry allows for the separation and lipids assignment from a single sample in a single scan (&lt;1 h). The described approach takes advantage of recent developments in data-dependent acquisition and data-independent acquisition, using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. The measurement of SIL at the fatty acid chain level reveals changes in lipid dynamics during the ovary development of mosquitoes. The lipids de novo structures are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

Presented here is a method for screening lipid structures through stable isotope labeling by using their retention time, mobility, and fragmentation.

Ricerca

Chimica

Calibration of the Mass Spectrometer for Screening Lipids with Stable Isotope Labeling by LC-TIMS-TOF MS/MS

To begin the mass spectrometer, or MS calibration for LC-TIMS-TOF-MS/MS, open the TIMS control software, and under the calibration sub-tab, click on m/z, select tuning mix from the Dropbox, and click calibrate at the bottom right corner. Continue to click calibrate until a score of 100%is achieved. Now select the mobility tab, and follow the same steps as demonstrated until the 100%calibration score is reached.To generate each calibration point in the calibration curve, spike the lipid internal standard mixture with 10 microliters of deuterated internal standard mixture. Prepare seven such spiked samples for seven calibration points in the desired range. Using the data analysis software, manually annotate the fatty acid chains based on the passive MS/MS patterns.To determine the stable isotope labeling, or SIL efficiency, calculate the ratio of the area of the SIL-containing isotopes to the area of the non-SIL-containing isotopes. Calculate the theoretical pattern by determining the probability of finding a labeled atom at any site. Calculate SIL enrichment by fitting the experimental isotope profiles with the theoretical pattern simulated on data analysis software.To start the run, activate the column oven by clicking the thermometer button, and activate the pumps by clicking the valve button. Set the MS method to the appropriate method saved earlier. Verify that the injection volume is five microliters, and line one target's vial 20 to one, and save the sample list.Start the sequence, and confirm successful injection by the message stating injected, displayed on the system. Copy line one, and paste it below to generate a new line two. Populate line two with samples depending on the experiment.Ensure that the correct position in the autosampler is used. If the mobile phases are fresh, first perform a peak shape test with the lipid mixture standards from the manufacturer, to compare it with previous results. The lipid mixture and the standards are displayed on the screen.Make sure new lines have the correct separation method, and not the preconditioning method used in line one. Ensure that MS method entered is correct. Check that the correct processing method is loaded, and the run automated process is enabled.Save the sample list to ensure samples are analyzed after the current run finishes.

Calibrazione dello spettrometro di massa per lo screening dei lipidi con marcatura isotopica stabile mediante LC-TIMS-TOF MS/MS

LC-TIMS-TOF MS/MS Data Analysis for Screening Lipids with Stable Isotope Labeling

To begin, open the data analysis software. At the top left corner, click on the file button and select open. To select the files of choice, right click on the file name and select properties.Then select calibration status. At the dropdown box, select internal calibration for the mass spectrometer. Ensure that all errors are less than one parts per million.After that, select internal mobility calibration and confirm that the error is less than one part per million. Next, right click on chromatogram and select edit chromatogram. At type, click the dropdown box and select extracted ion chromatogram.Under filter, select all MS, and for scan mode, select all to view the peaks for the molecule of interest rather than only its fragments. There are two filter options for molecule selection, masses or formula. If masses is selected, choose the theoretical M over Z of the molecule of interest, which in this case is 829.7985.If formula is selected, choose the formula for the molecule and the ion forms of interest, which in this case is ammonium. For width, select plus or minus one. For polarity, ensure that it maintains the positive mode.Under mobility, select 1.455 to 1.465 to isolate the molecule of interest and filter out molecules not falling within these values. Once the parameters are selected, click change followed by okay at the top right. After a brief time, the software will process the selections and output a chromatogram.Right click at the baseline of the origin of the peak of interest and drag while holding to the end of the peak to obtain a live mass spectrum of fragments within that retention time. Right click at the left of the screen on mobilogram and select edit mobilogram. A window named edit mobilogram traces will appear.Follow the steps demonstrated previously. For retention time, input the retention time of the peak of interest. Once the parameters are selected, click add, and okay at the top right.Wait till the software processes the selections and outputs a chromatogram. For extracting ions, repeat the steps demonstrated previously until a list of ions is formed. At the bottom of the MS window, select profile MS and fragment MS to allow a spectrum view of ions from a full scan and passive.For the spectrum view, right click and select copy compound spectra. The spectrum data that appears at the right can provide more information on the compound, such as resolution resolving power, intensity, and signal-to-noise ratio. To process the data, manually integrate the chromatogram and mobility peaks to yield valuable information on the molecule of interest.Right click find and select compounds manually chromatogram or mobilogram. Left click and highlight the desired peak. The obtained information includes retention time, area, signal-to-noise ratio, and mobility.