Os autores gostam de reconhecer as contribuições do Dr. Cesar Ramirez durante o desenvolvimento inicial do método. Esta pesquisa foi financiada pelas bolsas NIAID R21AI167849 para FGN, projeto 22-21244S da Czech Science Foundation, República Tcheca para MN.

1. Preparação da amostra
<ol><li>Dissecção de insetos<ol><li>Dissecar os ovários do mosquito Aedes aegypti aos 7 dias de idade em solução salina tamponada com fosfato usando microagulhas.</li>
		<li>Colete oito ovários da solução salina tamponada com fosfato usando microagulhas e armazene em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL a -80 ° C.</li>
		<li>Colete ovários em réplicas biológicas.</li>
	</ol></li>
	<li>Extração de lipídios<ol><li>Adicione 10 μL de padrão interno (ISTD) nos oito ovários coletados na concentração de 1 ppm. O ISTD é uma mistura lipídica marcada com sete deutério de 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina-D7 (15:0-18:1 (D7) PC), lisofosfatidilcolina-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadecanoil-2-octadecenoil-glicero-3-fosfoetanolamina-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadecanoil-3-octadecenoil-sn-glicerol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadecanoil-2-octadeceoil)-sn-glicerol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-octadeceoil-sn-glicerol-D7 (18:1 MAG (D7)), oleato de colesterol-D7 (18:1 (D7) Chol Ester).</li>
		<li>Espere até secar à temperatura ambiente. Adicione 100 μL de butanol/metanol e 3 μL de hidroxitolueno butilado. Homogeneizar manualmente por 10 s com pilões de polipropileno de 1,5 mL.</li>
		<li>Lave o pilão com 200 μL de butanol/metanol e misture com a solução homogeneizada.</li>
		<li>Sonicar o tubo de microcentrífuga à temperatura ambiente e potência média durante 30 min.</li>
		<li>Tubos de centrífuga a 1600 x g por 10 min a 20 °C. Transfira o sobrenadante para o frasco do amostrador automático com 300 μL de inserções de vidro silanizado.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Configuração do instrumento
<ol><li>Preparando a fase móvel<ol><li>Prepare a fase móvel com uma composição de 30:40:30 (fase móvel A) e 10:5:85 (fase móvel B) usando acetonitrila, água e isopropanol como respectiva proporção. Em ambas as fases móveis, adicione 10 mmol / L de formiato de amônio em água e 0,1% de ácido fórmico para criar uma condição tampão.</li>
		<li>Pesar 3,15 g de formiato de amónio em 10 ml de água. Adicione 500 μL desta solução em 12,5 mL de água. Em seguida, colocar num balão volumétrico de 250 ml e encher com isopropanol até cerca de 2/3 do balão. Misture girando.</li>
		<li>Adicione 250 μL de ácido fórmico (85%), encha com 25 mL de acetonitrila e isopropanol à linha de enchimento de 250 mL e misture.</li>
	</ol></li>
	<li>No sistema MS, no lado esquerdo da tela nas configurações do MS, determine a faixa de massa selecionando 50 como o mínimo e 1850 como a configuração de varredura máxima.<ol><li>Selecione Polaridade como modo de íon positivo. Selecione o modo de varredura como DIA-PASEF. Para fazer isso, selecione Ajustar e abrir o método de análise de um método DDA anterior com os seguintes parâmetros LC.<ol><li>Para separação de gradiente: Injeção de amostra: 0% B, tempo de espera 1 min. Aumente para 55% B, segure até 6,4 min. Aumente para 65% B, segure até 24 min. Aumente para 88% B, mantenha firme até 40,8 min. Aumente para 95% B, segure até 48,1 min. Diminua para 35% B, mantenha até 56 min. Diminua para 0% B, mantenha firme até 60 min.</li>
			<li>Para condições de HPLC: Volume de injeção: 5 μL Taxa de solvente: 0,25 mL / min Tempo total de execução: 60 min, em que 5 min são para pré-condicionar a coluna.</li>
			<li>Preparar o cromatógrafo líquido inserindo a coluna no cromatógrafo líquido. Execute um espaço em branco para limpar a coluna e testar se há vazamentos. Isso pode ser visto no instrumento que não mantém pressão ou fluxo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Para criar um novo método, execute as etapas descritas abaixo (Figura 1 e Figura 2).<ol><li>Abra o software e clique em Conectar todos os instrumentos. Se a conexão for bem-sucedida, o sistema LC emitirá um bipe e a tela de controle listará HyStar na caixa Status sem nenhuma mensagem de erro.</li>
		<li>Clique na guia Aquisição . No Navegador de Tabela de Exemplo, localize o menu suspenso de tags e selecione um método anterior.</li>
		<li>Duplique a tabela de amostra mais recente. Clique em Salvar como... e salve a nova lista de amostras com o formato: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) onde (XXXX) é um descritor curto da análise.</li>
		<li>Clique com o botão direito do mouse no método de separação e clique em Editar método. Clique em Editar método do módulo.</li>
		<li>Clique em Download. Se for bem-sucedido, o download bem-sucedido aparecerá. Feche a tela sem salvar o método.</li>
		<li>Em Configurações de MS, vá para Configurações de TIMS, selecione o início de 1/k0 em 0,70 e o final de 1/k0 em 1,85. Defina o tempo de rampa para 150 ms. Com isso, o ciclo de trabalho e a taxa de rampa são ajustados automaticamente.</li>
		<li>Na janela inferior, selecione a guia Origem . Selecione o tipo de fonte como ESI e defina o deslocamento da placa final para 800 V e o capilar para 4500 V. Verifique a caixa do nebulizador e ajuste a pressão para 4.0 bar. Ajuste o gás seco para 4.0 L/min e a temperatura seca para 250 °C.</li>
		<li>À direita da guia de origem, selecione a guia Tune. Clique na guia Sub Geral e, sob o título de transferência, verifique os seguintes parâmetros: Deflexão 1 delta: 70 V Funil 1 RF: 250 vpp isCID energia: 0 eV Funil 2 RF: 250 vpp RF multipolar: 500 vpp.<ol><li>Sob o cabeçalho da célula de colisão, verifique os seguintes parâmetros: Energia de colisão: 6,0 eV Colisão RF: 1200 vpp.</li>
			<li>Sob o título quadrupolo, certifique-se dos seguintes parâmetros: Energia iônica: 6 eV Baixa massa: 250 m/z.</li>
			<li>Na guia pré-TOF de foco, certifique-se dos seguintes parâmetros: Tempo de transferência: 45 μs Armazenamento pré-pulso: 5,0 μs.</li>
		</ol></li>
		<li>Clique na guia Subprocessamento de Processamento . Sob detecção de pico de espectro de massa, certifique-se dos seguintes parâmetros: Limiar absoluto: 667 Limiar absoluto (por 100 ms AccuTime): 445.<ol><li>Sob detecção de pico de mobilidade, certifique-se dos seguintes parâmetros: Limiar absoluto: 30,00.</li>
		</ol></li>
		<li>Clique na subguia TIMS . Na guia deslocamentos, garanta os seguintes parâmetros: Δt1: -20 V Δt2: -150 V Δt3: 70 V Δt4: 150 V Δt5: 0 V Δt6: 150 V Célula de colisão: 300 V.</li>
		<li>À direita da guia de ajuste, clique na guia MS/MS . Na guia de íons precursores, certifique-se dos seguintes parâmetros: Número de rampas PASEF: 8 Carga mínima: 1 Carga máxima:1.<ol><li>Na guia de agendamento, clique em Avançado e verifique os seguintes parâmetros: Intensidades: 0,1500, 5000, 10000 Repetição: 1, 10, 5, 1 Limiar de intensidade: 1500.</li>
			<li>Na guia de exclusão ativa, verifique os seguintes parâmetros: Marca de seleção de exclusão ativa Solte após: 0,4 min.</li>
			<li>Nas configurações de energia de colisão, garanta os seguintes parâmetros: K0 (V-s/cm3): 0,70, 1,60 Energia de colisão (eV): 20,00, 35,00.</li>
			<li>Nas configurações de largura de isolamento, verifique os seguintes parâmetros: Massa (m/z): 622, 1222 Largura (m/z): 1,00 2,50.</li>
		</ol></li>
		<li>Configuração do DIA-PASEF: Selecione DIA-PASEF no modo de varredura de configurações do MS à esquerda. Na guia MS/MS, selecione Editor de janelas. Aqui, assegure-se dos seguintes parâmetros (Figura 3): Configurações da janela: Largura da massa: 50 Da; Sobreposição de massa: 0,0 Da; Calcular a partir do polígono: passos de massa; Número de janelas de mobilidade: 1.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Calibração
<ol><li>Calibração do instrumento (Figura 4)<ol><li>Na subguia Calibração , clique em m/z, selecione Tuning Mix na caixa suspensa e clique em Calibrar no canto inferior direito.</li>
		<li>Continue clicando em Calibrar até que uma pontuação de 100% seja alcançada.</li>
		<li>Agora selecione a guia Mobilidade e siga as mesmas etapas acima até que a pontuação de calibração de 100% seja atingida.</li>
	</ol></li>
	<li>Curva de calibração<ol><li>Mistura de padrão interno de espiga lipídica com 10 μL de mistura de padrão interno deuterado. Use sete pontos de calibração de 0,1-500 ng/mL de mistura padrão com 10 μL da mistura de padrão interno deuterado.</li>
		<li>Anote manualmente as cadeias de ácidos graxos com base nos padrões PASEF MS / MS já descritos em2.</li>
	</ol></li>
	<li>Eficiência de rotulagem SIL<ol><li>Calcule a razão entre a área do SIL contendo isótopos e a área do isótopo não SIL</li>
		<li>Calcule o padrão teórico determinando a probabilidade de encontrar um átomo rotulado em qualquer local.</li>
		<li>Calcule o enriquecimento de SIL ajustando os perfis de isótopos experimentais com o padrão teórico simulado no software de análise de dados.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniciando a corrida<ol><li>Ative o forno de coluna clicando no botão Termômetro . Ative as bombas clicando no botão Válvula .</li>
		<li>Defina o método MS para o método salvo anteriormente. Verifique se o volume de injeção é de 5 μL e se a linha 1 terá como alvo o frasco 20:1.</li>
		<li>Certifique-se de que o frasco 20:1 tem 50% de IPA/ACN. Salve a lista de amostras.</li>
		<li>Inicie a sequência e verifique se uma injeção bem-sucedida foi feita (confirmada por uma mensagem exibida no sistema informando injetado).</li>
		<li>Copie a linha 1 e cole abaixo para gerar uma nova linha. Preencha a linha 2 com amostras, dependendo do experimento atual. Certifique-se de que a posição correta no amostrador automático seja usada.</li>
		<li>Se a fase móvel for recente, realize primeiro o teste de forma de pico injetando os padrões de mistura lipídica do fabricante. Compare com resultados anteriores. 2 Os padrões são uma mistura lipídica de 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolalina (15:0-18:1 PC), lisofosfatidilcolina (18:1 Lyso PC), 1-pentadecanoil-2-octadecenoil-glicero-3-fosfoetanolamina (15:0-18:1 PE), 1-oleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:1 Lyso PE), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoinositol (15:0-18:1 PI), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (15:0-18:1 PS), 1,2- dipentadecanoil-3-octadecenoil-sn-glicerol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadecanoil-2-octadecenoil)-sn-glicerol (15:0-18:1 DAG), 2-octadeceoil-sn-glicerol (18:1 MAG), oleato de colesterol (18:1 Chol Ester).</li>
		<li>Certifique-se de que as novas linhas tenham o método de separação correto e não o método de pré-condicionamento usado na linha 1. Certifique-se de que o método MS esteja correto (método do dia atual).</li>
		<li>Verifique se o método de processamento correto está carregado e se a opção Executar Processo Automatizado está ativada.</li>
		<li>Salve a lista de amostras para garantir que as amostras sejam analisadas após o término da execução atual.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise dos dados
<ol><li>Software de análise de dados abertos (Figura 5). No canto superior esquerdo, clique no botão Arquivo e selecione Abrir...</li>
	<li>Selecione os arquivos de sua escolha. Clique com o botão direito do mouse no nome do arquivo e selecione Propriedades.<ol><li>Selecione Status de calibração (Figura 6). Na caixa suspensa, selecione Calibração inicial para o espectrômetro de massa. Certifique-se de que todos os erros sejam inferiores a 1 ppm.</li>
		<li>Em seguida, selecione Calibração de mobilidade inicial e confirme se o erro é inferior a 1 ppm.</li>
		<li>Clique com o botão direito do mouse em Cromatograma e selecione Editar Cromatograma (Figura 6C). Em Tipo, clique na caixa suspensa e selecione Extraído Em filtro, selecione Todos os MS e, com o modo de verificação, selecione Todos. Isso é para ver os picos da molécula de interesse, em vez de apenas seus fragmentos.<ol><li>Abaixo disso, existem duas opções de filtro para seleção de moléculas: Massas ou Fórmula. Se Massas for selecionado, pode-se escolher o m/z teórico das moléculas de interesse. Para este caso, selecione 829,7985 m/z. Se Fórmula for selecionada, pode-se escolher a fórmula para a molécula, bem como as formas iônicas de interesse para o cromatograma. Neste caso, selecione amônio [M+NH4]. Isso se deve ao tampão de amônio na fase móvel que favorecerá a ionização nessa forma de íon (Figura 7).</li>
			<li>Para largura, selecione ±1. Para polaridade, certifique-se de manter o modo positivo. Em Mobilidade , selecione 1,455-1,465. Isso é feito para filtrar quaisquer moléculas que não se enquadrem nesses valores e isolar a molécula de interesse.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Depois que os parâmetros forem selecionados, clique em Adicionar > OK no canto superior direito. Após um curto período de tempo, o software processará as seleções e produzirá um cromatograma.</li>
	<li>Clique com o botão direito do mouse na linha de base no início do pico de interesse e arraste enquanto segura até o final do pico. Essa integração manual fornecerá um espectro de massa ao vivo de fragmentos dentro desse tempo de retenção.</li>
	<li>Mobilograma<ol><li>Clique com o botão direito do mouse à esquerda da tela em Mobilograma e selecione Editar Mobilograma (Figura 8). Uma janela chamada Editar Traços de Mobilograma aparecerá. Siga os mesmos passos C.e.i.1 a C.e.i.5 (Figura 9).</li>
		<li>Em Tempo de retenção , insira o tempo de retenção do pico de interesse. Neste caso, 37,45-37,55 min.</li>
		<li>Depois que os parâmetros forem selecionados, clique em Adicionar > OK no canto superior direito. Após um curto período de tempo, o software processará as seleções e produzirá um cromatograma.</li>
	</ol></li>
	<li>Para íons extraídos, repita as etapas 4.2.3.1-4.3.2.2 até formar uma lista de íons.</li>
	<li>Na parte inferior da janela MS, selecione Profile MS e Fragment MS. Isso permitirá uma visão do espectro de íons da varredura completa e PASEF.<ol><li>Na visualização do espectro, clique com o botão direito do mouse e selecione Copiar espectros compostos. Com os dados do espectro que aparecem à direita, pode-se encontrar mais informações sobre o composto, como resolução, poder de resolução, intensidade e relação sinal-ruído (S/N; Figura 10).</li>
	</ol></li>
	<li>Processamento<ol><li>Para processar os dados, integre manualmente o cromatograma e os picos de mobilidade para fornecer informações valiosas sobre a molécula de interesse (Figura 10).</li>
		<li>Clique com o botão direito do mouse em Localizar e selecione Integrar somente cromatograma ou mobilograma (Figura 11). Clique com o botão esquerdo e destaque o pico desejado. Essas informações incluem tempo de retenção, área, S/R e mobilidade.</li>
	</ol></li>
</ol>

Triagem de estruturas lipídicas usando marcação de isótopos estáveis

<ol>
	<li>Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotopically+labeled+internal+standards+in+quantitative+bioanalysis+using+liquid+chromatography/mass+spectrometry:+Necessity+or+not.">Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).</li><li>Tose, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+stable+isotope+labeling+and+liquid+chromatography-trapped+ion+mobility+spectrometry-time-of-flight-tandem+mass+spectrometry+for+de+novo+mosquito+ovarian+lipid+studies.">Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies.</a> Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).</li><li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics.">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).</li><li>Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+enhances+low-abundance+species+detection+in+untargeted+lipidomics.">Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics.</a> Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+parallel+accumulation-serial+fragmentation+(PASEF)+with+a+novel+trapped+ion+mobility+mass+spectrometer.">Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li><li>Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometric+approaches:+DIA,+WiSIM-DIA,+and+untargeted+DIA.">Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA.</a> Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+identification+strategy+on+the+reproducibility+of+the+DDA+and+DIA+results.">Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results.</a> J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).</li><li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+data+acquisition+and+processing+strategies+with+increased+throughput+and+selectivity:+PSMART+analysis+for+global+qualitative+and+quantitative+analysis.">Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).</li><li>Tsou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIA-umpire:+Comprehensive+computational+framework+for+data-independent+acquisition+proteomics.">DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics.</a> Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).</li><li>Triebl, A., Wenk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+considerations+of+stable+isotope+labelling+in+lipidomics.">Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics.</a> Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).</li></ol>

Matthew Willetts e Melvin A. Park são funcionários da Bruker Daltonics Inc, fabricante do instrumento comercial timsTOF. Os autores declaram não haver interesse financeiro conflitante.

Ao avaliar o uso deste protocolo, é essencial garantir que os parâmetros DIA-PASEF e MS/MS sejam aplicáveis aos triglicerídeos em questão. Especificamente, as janelas de mobilidade e a largura da janela devem seguir o padrão dos triglicerídeos. Isso pode ser determinado com uma execução anterior usando o método DDA. Ao rastrear os triglicerídeos no padrão interno, as janelas para a configuração do DIA devem cobrir todas as moléculas de interesse pré-identificadas. As janelas devem ser todas de tamanhos ig...

Ao analisar dados lipídicos, a marcação de isótopos estáveis (SIL) é um método eficaz para avaliar as vias metabólicas em organismos vivos. Neste método, os átomos dentro de um analito são substituídos por isótopos estáveis contendo 13C ou 2H. Esses isótopos são posteriormente incorporados aos precursores, que são posteriormente incorporados aos ácidos graxos, rotulando as áreas em que residem. Com esses isótopos, é possível identificar a distribuição e o metabolismo dos lipídios, pois eles contrastarão com o fundo não rotulado1. As plataformas comuns de espectrometria de massa não são capazes de distinguir o sinal proveniente de moléculas endógenas2. O sucesso do SIL requer o uso de ferramentas analíticas de ultra-alta resolução. A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de mobilidade iônica aprisionada de alta resolução - espectrometria de massa sequencial de fragmentação sequencial de acumulação sequencial - tempo de voo (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS / MS) permite a separação de espécies marcadas e não marcadas2. A vantagem da análise LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS é que o sinal MS pode ser filtrado pelo tempo de retenção (RT) e mobilidade, reduzindo assim potenciais interferências de moléculas endógenas, bem como quantificação e separação de todas as espécies desejadas2. No TIMS, um íon é primeiro mantido estacionário contra uma fase gás-móvel e posteriormente liberado de acordo com sua mobilidade. Isso fornece alta resolução Mobilogramas são gráficos de massa a carregar versus tempo de deriva que podem ser usados para distinguir entre compostos com base em seu tempo de deriva e quantidade de sobreposição4.
Usando uma técnica PASEF adicional, a velocidade de sequenciamento é bastante aumentada sem sacrificar a sensibilidade5. A teoria PASEF envolve o acúmulo de íons seguido por sua liberação sequencial na ordem de sua mobilidade. Isso é feito acumulando íons em alinhamento paralelo à sua mobilidade. O acúmulo dessa maneira evita a perda de íons. Além disso, a seleção do íon precursor ocorre simultaneamente com o acúmulo e a liberação dos íons. Com este método, o PASEF seleciona vários precursores em série durante cada varredura TIMS, em vez dos precursores individuais por varredura típicos de um instrumento TIMS que não usa PASEF. Quando os íons precursores são acumulados e liberados simultaneamente em picos de 2 ms em uma varredura TIMS de aproximadamente 100 ms por quadro, o sinal é amplificado em mais de uma ordem de magnitude, aumentando assim a relação sinal-ruído3. A adição do PASEF ao TIMS aumenta a eficiência do MS/MS. Como o TIMS-PASEF é acoplado ao MS/MS, é possível uma fragmentação mais eficiente. Ao contrário da detecção convencional de MS/MS, o sinal precursor é comprimido a partir do TIMS-PASEF e os íons fragmentos são detectados simultaneamente ao tempo de eluição do TIMS e à posição de mobilidade iônica do precursor3.
Ao adquirir dados de um espectrômetro de massa, existem opções no modo de varredura desejado. A aquisição dependente de dados (DDA) seleciona íons precursores da varredura MS1 com base em suas abundâncias, antes de fragmentá-los e realizar a varredura MS2. Este modo de varredura fragmenta o maior número possível de precursores. A abordagem DDA é direcionada e os resultados dependerão da seleção de íons3. No entanto, o DDA-PASEF frequentemente apresenta problemas na reprodutibilidade entre as repetições. Embora a DDA seja uma ótima ferramenta em uma análise focada, misturas complexas têm maior dificuldade em sua aquisição de dados6. Isso ocorre porque apenas uma pequena quantidade de íons pode ser monitorada simultaneamente3. A aquisição independente de dados (DIA) é um método em que as janelas pré-selecionadas de m/z são fragmentadas independentemente de sua intensidade e todas são verificadas dentro do intervalo7. Com este modo de varredura, nuvens de íons inteiras são transmitidas do IMS para o espectrômetro de massa3. Em estudos proteômicos, isso resulta em maiores quantidades de proteínas sendo quantificadas em um período de tempo mais curto em comparação com o DDA. Além disso, o DIA perde menos valores de m/z em comparação com o DDA. Portanto, esta alternativa mostrou grandes melhorias na reprodutibilidade dos dados na relação sinal-ruído e melhor quantificação do que o DDA. No presente trabalho, nosso objetivo é implementar a DIA ao método relatado por Tose et al.2. Melhoramos a reprodutibilidade e a intensidade dos sinais, produzindo informações adicionais e mais conclusivas sobre a mobilização, distribuição e metabolismo de lipídios SIL em amostras biológicas aproveitando a aquisição de DDA e DIA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accucore C30 colum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27826-252130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Compass Data Analysis</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>2363525870</td>
			<td>Version 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose-13C6</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EquiSplash Lipidomix</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330731-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-417-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heavy water (2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>1.13366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene pestles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BAF199230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>L20234651907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silanized glass inserts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-251-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose-13C12</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>605417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>timsTOF</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>1.84443E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuning Mix Calibration Standard</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>36</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing de novo lipids using stable isotope labeling lc-tims-tof ms/ms

Os lipídios são altamente diversos e pequenas mudanças nas estruturas e composição lipídicas podem ter efeitos profundos nas funções biológicas críticas. A marcação de isótopos estáveis (SIL) oferece várias vantagens para o estudo da distribuição, mobilização e metabolismo de lipídios, bem como para a síntese lipídica de novo . A implementação bem-sucedida da técnica SIL requer a remoção de interferências de moléculas endógenas. No presente trabalho, descrevemos um protocolo analítico de alto rendimento para a triagem de lipídios SIL de amostras biológicas; Serão mostrados exemplos de identificação de lipídios de novo durante o desenvolvimento do ovário do mosquito. O uso de cromatografia líquida complementar, espectrometria de mobilidade de íons aprisionados e espectrometria de massa permite a separação e atribuição de lipídios de uma única amostra em uma única varredura (<1 h). A abordagem descrita aproveita os desenvolvimentos recentes na aquisição dependente de dados e aquisição independente de dados, usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade seguida de fragmentação sequencial e dissociação induzida por colisão. A medição do SIL no nível da cadeia de ácidos graxos revela mudanças na dinâmica lipídica durante o desenvolvimento do ovário dos mosquitos. As estruturas lipídicas de novo são atribuídas com confiança com base em seu tempo de retenção, mobilidade e padrão de fragmentação.

When analyzing lipid data, stable isotope labeling (SIL) is an effective method to assess metabolic pathways in living organisms. In this method, atoms within an analyte are replaced by stable isotopes containing 13C or 2H. These isotopes are further incorporated into precursors, which are later embedded within the fatty acids, labeling the areas in which they reside. With these isotopes, one is able to identify the distribution and metabolism of lipids, as they will contrast against the unlabeled background1. Common mass spectrometry platforms are not able to distinguish the signal coming from endogenous molecules2. The success of SIL requires the use of ultrahigh-resolution analytical tools. Liquid chromatography coupled to high-resolution trapped ion mobility spectrometry-parallel accumulation sequential fragmentation-time-of-flight tandem mass spectrometry (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) allows the separation of labeled and nonlabelled species2. The advantage of LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analysis is that the MS signal can be filtered by the retention time (RT) and mobility, thus reducing potential interferences of endogenous molecules, as well as quantification and separation of all desired species2. In TIMS, an ion is first held stationary against a gas-mobile phase and subsequently released according to its mobility. This provides high-resolution mobilograms while operating at a lower voltage than earlier IMS instrumentation3. Mobilograms are plots of mass to charge versus drift time that can be used to distinguish between compounds based off of their drift time and amount of overlap4.
By using an additional PASEF technique, sequencing speed is greatly increased without sacrificing sensitivity5. The PASEF theory involves the accumulation of ions followed by their sequential release in the order of their mobility. This is done by accumulating ions in parallel alignment to their mobility. The accumulation in this fashion prevents ion loss. Furthermore, the precursor ion selection occurs simultaneously with the accumulation and release of the ions. With this method, PASEF selects multiple precursors in series during each TIMS scan, rather than the individual precursors per scan typical of a TIMS instrument that does not use PASEF. When the precursor ions are concurrently accumulated and released in 2 ms peaks within a TIMS scan of approximately 100 ms per frame, the signal is amplified by over one order of magnitude, therefore increasing the signal-to-noise ratio3. The PASEF addition to the TIMS increases the efficiency of the MS/MS. As the TIMS-PASEF is coupled with MS/MS, a more efficient fragmentation is possible. Unlike conventional MS/MS detection, the precursor signal is compressed from the TIMS-PASEF, and the fragment ions are detected simultaneously to the TIMS elution time and ion mobility position of the precursor3.
When acquiring data from a mass spectrometer, there are options in the scan mode desired. Data dependent acquisition (DDA) selects precursor ions from the MS1 scan based on their abundances, before fragmenting them and performing the MS2 scan. This scan mode fragments as many precursors as possible. The DDA approach is targeted, and results will depend on the ion selection3. However, DDA-PASEF often has problems in the reproducibility between replicates. While DDA is a great tool in a focused analysis, complex mixtures have greater difficulty in their data acquisition6. This is because only a small amount of ions can be monitored simultaneously3. Data independent acquisition (DIA) is a method where preselected windows of m/z are fragmented independently from their intensity, and all are scanned within the range7. With this scan mode, entire ion clouds are transmitted from the IMS to the mass spectrometer3. In proteomics studies this results in greater amounts of proteins being quantified in a shorter time span compared to DDA. In addition, DIA misses fewer m/z values compared to DDA. Therefore, this alternative has shown great improvements in data reproducibility in signal to noise ratio and better quantification than DDA. In this present work, our goal is to implement DIA to the method reported by Tose et al.2. We improved the reproducibility and intensity of signals, yielding further and more conclusive information on SIL lipids mobilization, distribution and metabolism in biological samples taking advantage of DDA and DIA acquisition.

Autor em destaque: Quantificação de amostras lipidômicas complexas usando marcação de isótopos estáveis

Rastreamento de lipídios de novo usando marcação de isótopos estáveis LC-TIMS-TOF MS/MS

This research intends to implement more specific quantification in lipidomic samples using stable isotope labeling. This allows us to understand lipid panels and highly diverse samples from insects to humans. There currently is a gap in this field regarding the standardization of LC, TIMS, Top, MS/MS in lipidomic investigations.Here we provide a method for tracking biomass remains for this purpose. In the future, our research will involve the investigation of epigenetics and metabolomics present in the biological process using the LC team staff, MS/MS, involve DDA and DIA methods.

A marcação de isótopos estáveis facilita a visualização de triglicerídeos em estudos de dinâmica lipídica de ovários de mosquitos fêmeas. No domínio da mobilidade 2D, o triglicerídeo 48:1 é exibido em uma região com um tempo de retenção específico em relação à mobilidade 1/K0. A intensidade do triglicerídeo pode ser visualizada por uma linha azul mais escura. Outras manchas representam triglicerídeos adicionais encontrados no ovário. Os tempos de retenção e mobilidades variam devido ?...

Aqui é apresentado um método para triagem de estruturas lipídicas por meio da marcação de isótopos estáveis, usando seu tempo de retenção, mobilidade e fragmentação.

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

Esta pesquisa pretende implementar quantificação mais específica em amostras lipidômicas usando marcação isotópica estável. Isso nos permite entender os painéis lipídicos e amostras altamente diversas, de insetos a humanos. Atualmente, existe uma lacuna nesse campo quanto à padronização de LC, TIMS, Top, MS/MS em investigações lipidômicas.Aqui, fornecemos um método para rastrear restos de biomassa para esse fim. No futuro, nossa pesquisa envolverá a investigação da epigenética e metabolômica presentes no processo biológico usando a equipe de LC, MS / MS, envolvendo métodos DDA e DIA.

tracing-de-novo-lipids-using-stable-isotope-labeling-lc-tims-tof-msms

Research

JoVE Journal

Chemistry

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

728 visualizações.  Florida International University. Esta pesquisa pretende implementar quantificação mais específica em amostras lipidômicas usando marcação isotópica estável. Isso nos permite entender os painéis lipídicos e amostras altamente diversas, de insetos a humanos. Atualmente, existe uma lacuna nesse campo quanto à padronização de LC, TIMS, Top, MS/MS em investigações lipidômicas.Aqui, fornecemos um método para rastrear restos de biomassa para esse fim. No futuro, nossa pesquisa envolverá a investigação da ...

Vídeo: Autor em destaque: Quantificação de amostras lipidômicas complexas usando marcação de isótopos estáveis

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable isotope labeling (SIL) offers several advantages for the study of lipid distribution, mobilization, and metabolism, as well as de novo lipid synthesis. The successful implementation of the SIL technique requires the removal of interferences from endogenous molecules. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of SIL lipids from biological samples; examples will be shown of lipid de novo identification during mosquito ovary development. The use of complementary liquid chromatography trapped ion mobility spectrometry and mass spectrometry allows for the separation and lipids assignment from a single sample in a single scan (&lt;1 h). The described approach takes advantage of recent developments in data-dependent acquisition and data-independent acquisition, using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. The measurement of SIL at the fatty acid chain level reveals changes in lipid dynamics during the ovary development of mosquitoes. The lipids de novo structures are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

Presented here is a method for screening lipid structures through stable isotope labeling by using their retention time, mobility, and fragmentation.

Química

Calibration of the Mass Spectrometer for Screening Lipids with Stable Isotope Labeling by LC-TIMS-TOF MS/MS

To begin the mass spectrometer, or MS calibration for LC-TIMS-TOF-MS/MS, open the TIMS control software, and under the calibration sub-tab, click on m/z, select tuning mix from the Dropbox, and click calibrate at the bottom right corner. Continue to click calibrate until a score of 100%is achieved. Now select the mobility tab, and follow the same steps as demonstrated until the 100%calibration score is reached.To generate each calibration point in the calibration curve, spike the lipid internal standard mixture with 10 microliters of deuterated internal standard mixture. Prepare seven such spiked samples for seven calibration points in the desired range. Using the data analysis software, manually annotate the fatty acid chains based on the passive MS/MS patterns.To determine the stable isotope labeling, or SIL efficiency, calculate the ratio of the area of the SIL-containing isotopes to the area of the non-SIL-containing isotopes. Calculate the theoretical pattern by determining the probability of finding a labeled atom at any site. Calculate SIL enrichment by fitting the experimental isotope profiles with the theoretical pattern simulated on data analysis software.To start the run, activate the column oven by clicking the thermometer button, and activate the pumps by clicking the valve button. Set the MS method to the appropriate method saved earlier. Verify that the injection volume is five microliters, and line one target's vial 20 to one, and save the sample list.Start the sequence, and confirm successful injection by the message stating injected, displayed on the system. Copy line one, and paste it below to generate a new line two. Populate line two with samples depending on the experiment.Ensure that the correct position in the autosampler is used. If the mobile phases are fresh, first perform a peak shape test with the lipid mixture standards from the manufacturer, to compare it with previous results. The lipid mixture and the standards are displayed on the screen.Make sure new lines have the correct separation method, and not the preconditioning method used in line one. Ensure that MS method entered is correct. Check that the correct processing method is loaded, and the run automated process is enabled.Save the sample list to ensure samples are analyzed after the current run finishes.

Calibração do Espectrômetro de Massas para Triagem de Lipídios com Marcação de Isótopos Estáveis por LC-TIMS-TOF MS/MS

LC-TIMS-TOF MS/MS Data Analysis for Screening Lipids with Stable Isotope Labeling

To begin, open the data analysis software. At the top left corner, click on the file button and select open. To select the files of choice, right click on the file name and select properties.Then select calibration status. At the dropdown box, select internal calibration for the mass spectrometer. Ensure that all errors are less than one parts per million.After that, select internal mobility calibration and confirm that the error is less than one part per million. Next, right click on chromatogram and select edit chromatogram. At type, click the dropdown box and select extracted ion chromatogram.Under filter, select all MS, and for scan mode, select all to view the peaks for the molecule of interest rather than only its fragments. There are two filter options for molecule selection, masses or formula. If masses is selected, choose the theoretical M over Z of the molecule of interest, which in this case is 829.7985.If formula is selected, choose the formula for the molecule and the ion forms of interest, which in this case is ammonium. For width, select plus or minus one. For polarity, ensure that it maintains the positive mode.Under mobility, select 1.455 to 1.465 to isolate the molecule of interest and filter out molecules not falling within these values. Once the parameters are selected, click change followed by okay at the top right. After a brief time, the software will process the selections and output a chromatogram.Right click at the baseline of the origin of the peak of interest and drag while holding to the end of the peak to obtain a live mass spectrum of fragments within that retention time. Right click at the left of the screen on mobilogram and select edit mobilogram. A window named edit mobilogram traces will appear.Follow the steps demonstrated previously. For retention time, input the retention time of the peak of interest. Once the parameters are selected, click add, and okay at the top right.Wait till the software processes the selections and outputs a chromatogram. For extracting ions, repeat the steps demonstrated previously until a list of ions is formed. At the bottom of the MS window, select profile MS and fragment MS to allow a spectrum view of ions from a full scan and passive.For the spectrum view, right click and select copy compound spectra. The spectrum data that appears at the right can provide more information on the compound, such as resolution resolving power, intensity, and signal-to-noise ratio. To process the data, manually integrate the chromatogram and mobility peaks to yield valuable information on the molecule of interest.Right click find and select compounds manually chromatogram or mobilogram. Left click and highlight the desired peak. The obtained information includes retention time, area, signal-to-noise ratio, and mobility.