Yazarlar, ilk yöntem geliştirmeleri sırasında Dr. Cesar Ramirez'in katkılarını kabul etmek isterler. Bu araştırma, FGN'ye R21AI167849 NIAID hibeleri, Çek Cumhuriyeti'ndeki Çek Bilim Vakfı'ndan MN'ye 22-21244S projesi tarafından finanse edilmiştir.

1. Numune hazırlama
<ol><li>Böcek diseksiyonu<ol><li>Aedes aegypti sivrisinek yumurtalıklarını 7 günlükken mikroiğneler kullanarak fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisinde inceleyin.</li>
		<li>Mikroiğneler kullanarak fosfat tamponlu salin solüsyonundan sekiz yumurtalık toplayın ve -80 ° C'de 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın.</li>
		<li>Biyolojik kopyalarda yumurtalıkları toplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Lipid ekstraksiyonu<ol><li>Toplanan sekiz yumurtalığa 1 ppm'lik bir konsantrasyonda 10 μL iç standart (ISTD) ekleyin. ISTD, yedi döteryumlu 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin-D7 (15:15) içeren etiketli bir lipit karışımıdır. 0-18:1 (D7) PC), lizofosfatidilkolin-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadekanoil-2-oktadekenoil-glisero-3-fosfoetanolamin-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoil-2-hidroksi-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadekanoyl-3-oktadekenoil-sn-gliserol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadekanoil-2-oktadekenoil)-sn-gliserol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-oktadekenoil-sn-gliserol-D7 (18:1 MAG (D7)), kolesteril oleat-D7 (18:1 (D7) Chol Ester).</li>
		<li>Oda sıcaklığında kuruyana kadar bekleyin. 100 μL bütanol/metanol ve 3 μL bütillenmiş hidroksitoluen ekleyin. 1,5 mL polipropilen tokmak ile 10 saniye boyunca manuel olarak homojenize edin.</li>
		<li>Havaneli 200 μL bütanol/metanol ile durulayın ve homojenize çözelti ile birleştirin.</li>
		<li>Mikrosantrifüj tüpünü oda sıcaklığında ve orta güçte 30 dakika boyunca sonikasyon.</li>
		<li>Tüpleri 20 °C'de 10 dakika boyunca 1600 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı 300 μL silanize cam ekler ile otomatik numune alma cihazına aktarın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Enstrüman kurulumu
<ol><li>Mobil fazın hazırlanması<ol><li>İlgili oran olarak asetonitril, su ve izopropanol kullanarak 30:40:30 (mobil faz A) ve 10:5:85 (mobil faz B) bileşimine sahip mobil fazı hazırlayın. Her iki mobil fazda da, bir tampon koşulu oluşturmak için suya 10 mmol/L amonyum format ve %0.1 formik asit ekleyin.</li>
		<li>10 mL suda 3.15 g amonyum formatı tartın. Bu çözeltinin 500 μL'sini 12.5 mL suya ekleyin. Sırayla, 250 mL'lik hacimsel bir şişeye koyun ve şişenin yaklaşık 2 / 3'üne kadar izopropanol ile doldurun. Döndürerek karıştırın.</li>
		<li>250 μL formik asit (% 85) ekleyin, 250 mL'lik doldurma hattına 25 mL asetonitril ve izopropanol ile doldurun ve karıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>MS sisteminde, MS ayarlarında ekranın sol tarafında, minimum tarama ayarı olarak 50'yi ve maksimum tarama ayarı olarak 1850'yi seçerek kütle aralığını belirleyin.<ol><li>Pozitif iyon modu olarak Polarite'yi seçin. Tarama modunu DIA-PASEF olarak seçin. Bunu yapmak için, aşağıdaki LC parametreleriyle önceki bir DDA yönteminden Analiz yöntemini ayarlayın ve açın'ı seçin.<ol><li>Degrade ayrımı için: Numune enjeksiyonu:% 0 B, tutma süresi 1 dak. %55 B'ye yükseltin, 6.4 dakikaya kadar basılı tutun. %65 B'ye yükseltin, 24 dakikaya kadar basılı tutun. %88 B'ye yükseltin, 40,8 dakikaya kadar basılı tutun. %95 B'ye yükseltin, 48,1 dakikaya kadar basılı tutun. % 35 B'ye düşürün, 56 dakikaya kadar basılı tutun. % 0 B'ye düşürün, 60 dakikaya kadar basılı tutun.</li>
			<li>HPLC koşulları için: Enjeksiyon hacmi: 5 μL Çözücü oranı: 0,25 mL/dak Toplam çalışma süresi: 60 dakika, bunun 5 dakikası sütunu ön koşullandırmak içindir.</li>
			<li>Kolonu sıvı kromatografına yerleştirerek sıvı kromatografını hazırlayın. Sütunu temizlemek ve sızıntı olup olmadığını test etmek için bir boşluk çalıştırın. Bu, cihazın basınç veya akış tutmamasında görülebilir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Yeni bir yöntem oluşturmak için aşağıda açıklanan adımları gerçekleştirin (Şekil 1 ve Şekil 2).<ol><li>Yazılımı açın ve Tüm enstrümanları bağla'ya tıklayın. Bağlantı başarılı olursa, LC sistemi bir kez bip sesi çıkarır ve kontrol ekranı, herhangi bir hata mesajı olmadan Durum kutusunda HyStar'ı listeler.</li>
		<li>Edinme sekmesine tıklayın. Örnek Tablo Gezgini'nde, etiket açılır menüsünü bulun ve önceki bir yöntemi seçin.</li>
		<li>En son örnek tabloyu ikiye katlayın. Farklı Kaydet... 'e tıklayın ve yeni örnek listeyi şu biçimde kaydedin: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) burada (XXXX) analizin kısa bir tanımlayıcısıdır.</li>
		<li>Ayırma yöntemine sağ tıklayın ve Yöntemi Düzenle'ye tıklayın. Modül Yöntemini Düzenle'ye tıklayın.</li>
		<li>İndir'e tıklayın. Başarılı olursa, İndirme başarılı oldu açılır pencere. Kaydetme yöntemi olmadan ekranı kapatın.</li>
		<li>MS ayarları altında TIMS ayarlarına gidin, 1/k0 başlangıcını 0,70'te ve 1/k0 bitişini 1,85'te seçin. Rampa süresini 150 ms olarak ayarlayın. Bununla, görev döngüsü ve rampa hızı otomatik olarak ayarlanır.</li>
		<li>Alt pencerede, Kaynak sekmesini seçin. Kaynak tipini ESI olarak seçin ve uç plaka ofsetini 800 V'a ve kılcal damarı 4500 V'a ayarlayın. Nebulizatör kutusunu kontrol edin ve basıncı 4,0 bar'a ayarlayın. Kuru gazı 4,0 L/dk'ya ve kuru sıcaklığı 250 °C'ye ayarlayın.</li>
		<li>Kaynak sekmesinin sağında, Ayar sekmesini seçin. Genel Alt sekmesine tıklayın ve aktarım başlığı altında aşağıdaki parametrelerin sağlandığından emin olun: Sapma 1 delta: 70 V Huni 1 RF: 250 vpp isCID enerjisi: 0 eV Huni 2 RF: 250 vpp Çok kutuplu RF: 500 vpp.<ol><li>Çarpışma hücresi başlığı altında aşağıdaki parametrelerden emin olun: Çarpışma enerjisi: 6.0 eV Çarpışma RF: 1200 vpp.</li>
			<li>Dört kutuplu başlık altında aşağıdaki parametrelerden emin olun: İyon enerjisi: 6 eV Düşük kütle: 250 m/z.</li>
			<li>Odak öncesi TOF sekmesi altında aşağıdaki parametrelerden emin olun: Aktarım süresi: 45 μs Darbe öncesi depolama: 5.0 μs.</li>
		</ol></li>
		<li>İşleme Alt sekmesine tıklayın. Kütle spektrumları tepe tespiti altında aşağıdaki parametrelerden emin olun: Mutlak eşik: 667 Mutlak eşik (100 ms AccuTime başına): 445.<ol><li>Hareketlilik tepe algılaması altında aşağıdaki parametrelerden emin olun: Mutlak eşik: 30.00.</li>
		</ol></li>
		<li>TIMS alt sekmesine tıklayın. Uzaklıklar sekmesi altında aşağıdaki parametrelerden emin olun: Δt1: -20 V Δt2: -150 V Δt3: 70 V Δt4: 150 V Δt5: 0 V Δt6: 150 V Çarpışma hücresi: 300 V.</li>
		<li>Ayar sekmesinin sağında, MS/MS sekmesine tıklayın. Öncü iyonlar sekmesi altında aşağıdaki parametrelerden emin olun: PASEF rampa sayısı: 8 Minimum şarj: 1 Maksimum şarj:1.<ol><li>Planlama sekmesi altında, Gelişmiş'i tıklatın ve aşağıdaki parametrelerin sağlandığından emin olun: Yoğunluklar: 0,1500, 5000, 10000 Tekrar: 1, 10, 5, 1 Yoğunluk Eşiği: 1500.</li>
			<li>Etkin dışlama sekmesi altında aşağıdaki parametrelerden emin olun: Etkin dışlama onay işareti Sonra bırakın: 0.4 dk.</li>
			<li>Çarpışma altında enerji ayarları aşağıdaki parametrelerden emin olun: K0 (V-s/cm3): 0.70, 1.60 Çarpışma enerjisi (eV): 20.00, 35.00.</li>
			<li>İzolasyon genişliği ayarları altında aşağıdaki parametrelerden emin olun: Kütle (m/z): 622, 1222 Genişlik (m/z): 1.00 2.50.</li>
		</ol></li>
		<li>DIA -PASEF kurulumu: Soldaki MS ayarları tarama modundan DIA-PASEF'i seçin. MS/MS sekmesi altında Pencere Düzenleyicisi'ni seçin. Burada, aşağıdaki parametrelerin olduğundan emin olun (Şekil 3): Pencere ayarları: Kütle genişliği: 50 Da; Kütle örtüşmesi: 0.0 Da; Çokgenden hesaplayın: kütle adımları; Hareketlilik pencerelerinin sayısı: 1.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kalibrasyon
<ol><li>Cihaz kalibrasyonu (Şekil 4)<ol><li>Kalibrasyon alt sekmesi altında m/z'ye tıklayın, açılır kutudan Tuning Mix'i seçin ve sağ alt köşedeki Kalibre Et'e tıklayın.</li>
		<li>%100 puan elde edilene kadar Ayarla'ya tıklamaya devam edin.</li>
		<li>Şimdi Mobilite sekmesini seçin ve %100 kalibrasyon puanına ulaşılana kadar yukarıdaki adımların aynısını izleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrasyon eğrisi<ol><li>10 μL döteryumlu iç standart karışım ile lipit iç standart karışımını birleştirin. 0.1-500 ng / mL standart karışımdan 10 μL döteryumlu iç standart karışım ile yedi kalibrasyon noktası kullanın.</li>
		<li>2'de daha önce açıklanan PASEF MS/MS modellerine dayalı olarak yağ asidi zincirlerine manuel olarak açıklama ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>SIL etiketleme verimliliği<ol><li>SIL içeren izotopların alanının, SIL içermeyen izotopların alanına oranını hesaplayın.</li>
		<li>Herhangi bir yerde etiketli bir atom bulma olasılığını belirleyerek teorik patteni hesaplayın.</li>
		<li>Deneysel izotop profillerini veri analizi yazılımında simüle edilen teorik modelle uyumlu hale getirerek SIL zenginleştirmesini hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Çalıştırmayı başlatma<ol><li>Termometre düğmesine tıklayarak sütun fırınını etkinleştirin. Vana düğmesine tıklayarak pompaları etkinleştirin.</li>
		<li>MS yöntemini daha önce kaydedilen yönteme ayarlayın. Enjeksiyon hacminin 5 μL olduğunu ve satır 1'in flakon 20:1'i hedefleyeceğini doğrulayın.</li>
		<li>Flakon 20:1'in %50 IPA/ACN'ye sahip olduğundan emin olun. Örnek listeyi kaydedin.</li>
		<li>Sırayı başlatın ve başarılı bir enjeksiyonun yapıldığını doğrulayın (sistemde enjekte edildiğini belirten bir mesajla onaylanır).</li>
		<li>Yeni bir satır oluşturmak için 1. satırı kopyalayın ve aşağıya yapıştırın. Mevcut deneye bağlı olarak satır 2'yi örneklerle doldurun. Otomatik örnekleyicide doğru konumun kullanıldığından emin olun.</li>
		<li>Mobil faz taze ise, önce üreticiden lipit karışım standartlarını enjekte ederek tepe şekli testini gerçekleştirin. Önceki sonuçlarla karşılaştırın. 2 Standartlar, 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (15:0-18:1 PC), lizofosfatidilkolin (18:1 Lyso PC), 1-pentadekanoil-2-oktadekenoil-glisero-3-fosfoetanolamin (15:0-18:1 PE), 1-oleoil-2-hidroksi-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (18:1 Lyso PE), 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoinositol (15:0-18:1 PI), 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (15:0-18:1 PS), 1,2- dipentadekanoyl-3-oktadekenoil-sn-gliserol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadekanoil-2-oktadekenoil)-sn-gliserol (15:0-18:1 DAG), 2-oktadekenoil-sn-gliserol (18:1 MAG), kolesteril oleat (18:1 Chol Ester).</li>
		<li>Yeni satırların doğru ayırma yöntemine sahip olduğundan ve satır 1'de kullanılan ön koşullandırma yöntemine sahip olmadığından emin olun. MS yönteminin doğru olduğundan emin olun (mevcut günün yöntemi).</li>
		<li>Doğru işleme yönteminin yüklendiğini ve Otomatik İşlemi Çalıştır'ın etkinleştirildiğini kontrol edin.</li>
		<li>Geçerli çalışma bittikten sonra örneklerin analiz edildiğinden emin olmak için örnek listesini kaydedin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Veri analizi
<ol><li>Açık Veri Analizi yazılımı (Şekil 5). Sol üst köşede Dosya düğmesine tıklayın ve Aç'ı seçin...</li>
	<li>Tercih ettiğiniz dosyaları seçin. Dosya adına sağ tıklayın ve Özellikler'i seçin.<ol><li>Kalibrasyon durumunu seçin (Şekil 6). Açılır kutuda, kütle spektrometresi için İlk Kalibrasyon'u seçin. Tüm hataların 1 ppm'den az olduğundan emin olun.</li>
		<li>Ardından, İlk Hareketlilik Kalibrasyonu'nu seçin ve hatanın 1 ppm'den az olduğunu onaylayın.</li>
		<li>Kromatogram'a sağ tıklayın ve Kromatogramı Düzenle'yi seçin (Şekil 6C). Type (Tür) bölümünde, açılır kutuya tıklayın ve Ekstrakte Edilmiş İyon Kromatogramı'nı seçin (Şekil 6D). Filtre altında, Tüm MS'yi seçin ve tarama modu ile Tümü'nü seçin. Bu, ilgilenilen molekülün yalnızca parçalarından ziyade zirvelerini görmek içindir.<ol><li>Bunun altında, molekül seçimi için iki filtre seçeneği vardır: Kütleler veya Formül. Kütleler seçilirse, ilgilenilen moleküllerin teorik m/z'si seçilebilir. Bu durumda 829.7985 m/z'yi seçin. Formül seçilirse, molekül için formülün yanı sıra kromatogram için ilgilenilen iyon formları da seçilebilir. Bu durumda, amonyum [M+NH4] seçin. Bunun nedeni, bu iyon formunda iyonlaşmayı destekleyecek olan mobil fazdaki amonyum tamponudur (Şekil 7).</li>
			<li>Genişlik için ±1'i seçin. Polarite için pozitif modu koruduğundan emin olun. Hareketlilik altında 1.455-1.465'i seçin. Bu, bu değerlere girmeyen molekülleri filtrelemek ve ilgilenilen molekülü izole etmek için yapılır.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Parametreler seçildikten sonra, sağ üstteki Ekle > Tamam'ı tıklayın. Kısa bir süre sonra, yazılım seçimleri işleyecek ve bir kromatogram çıkaracaktır.</li>
	<li>İlgilenilen zirvenin başındaki taban çizgisine sağ tıklayın ve zirvenin sonuna kadar basılı tutarak sürükleyin. Bu manuel entegrasyon, bu tutma süresi içinde canlı bir parça kütle spektrumu sağlayacaktır.</li>
	<li>Mobilogram<ol><li>Mobilogram'da ekranın sol tarafına sağ tıklayın ve Mobilogramı Düzenle'yi seçin (Şekil 8). Edit Mobilogram Traces (Mobilogram İzlerini Düzenle) adlı bir pencere açılacaktır. C.e.i.1'den C.e.i.5'e kadar olan aynı adımları izleyin (Şekil 9).</li>
		<li>Saklama Süresinde, ilgilenilen zirvenin tutma süresini girin. Bu durumda, 37.45-37.55 dk.</li>
		<li>Parametreler seçildikten sonra, sağ üstteki Ekle > Tamam'ı tıklayın. Kısa bir süre sonra, yazılım seçimleri işleyecek ve bir kromatogram çıkaracaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Ekstrakte edilen iyonlar için, bir iyon listesi oluşana kadar 4.2.3.1-4.3.2.2 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>MS penceresinin alt kısmında, MS Profili ve Parça MS'yi seçin. Bu, tam tarama ve PASEF'ten iyonların spektrum görünümüne izin verecektir.<ol><li>Spektrum görünümünde, sağ tıklayın ve Bileşik Spektrumları Kopyala'yı seçin. Sağda görünen spektrum verileriyle, çözünürlük çözme gücü, yoğunluk ve sinyal-gürültü oranı (S/N; Şekil 10).</li>
	</ol></li>
	<li>Işleme<ol><li>Verileri işlemek için, ilgilenilen molekül hakkında değerli bilgiler elde etmek için kromatogramı ve hareketlilik tepe noktalarını manuel olarak entegre edin (Şekil 10).</li>
		<li>Bul'a sağ tıklayın ve Yalnızca Entegre Et'i seçin kromatogram veya mobilogram (Şekil 11). Sol tıklayın ve istediğiniz zirveyi vurgulayın. Bu bilgiler saklama süresini, alanı, S/N'yi ve hareketliliği içerir.</li>
	</ol></li>
</ol>

Kararlı İzotop Etiketleme Kullanarak Lipid Yapılarının Taranması

<ol>
	<li>Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotopically+labeled+internal+standards+in+quantitative+bioanalysis+using+liquid+chromatography/mass+spectrometry:+Necessity+or+not.">Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).</li><li>Tose, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+stable+isotope+labeling+and+liquid+chromatography-trapped+ion+mobility+spectrometry-time-of-flight-tandem+mass+spectrometry+for+de+novo+mosquito+ovarian+lipid+studies.">Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies.</a> Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).</li><li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics.">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).</li><li>Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+enhances+low-abundance+species+detection+in+untargeted+lipidomics.">Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics.</a> Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+parallel+accumulation-serial+fragmentation+(PASEF)+with+a+novel+trapped+ion+mobility+mass+spectrometer.">Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li><li>Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometric+approaches:+DIA,+WiSIM-DIA,+and+untargeted+DIA.">Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA.</a> Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+identification+strategy+on+the+reproducibility+of+the+DDA+and+DIA+results.">Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results.</a> J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).</li><li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+data+acquisition+and+processing+strategies+with+increased+throughput+and+selectivity:+PSMART+analysis+for+global+qualitative+and+quantitative+analysis.">Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).</li><li>Tsou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIA-umpire:+Comprehensive+computational+framework+for+data-independent+acquisition+proteomics.">DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics.</a> Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).</li><li>Triebl, A., Wenk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+considerations+of+stable+isotope+labelling+in+lipidomics.">Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics.</a> Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).</li></ol>

Matthew Willetts ve Melvin A. Park, timsTOF ticari enstrümanının üreticisi olan Bruker Daltonics Inc.'in çalışanlarıdır. Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Bu protokolün kullanımını değerlendirirken, DIA-PASEF ve MS/MS parametrelerinin söz konusu trigliseritlere uygulanabilir olduğundan emin olmak önemlidir. Spesifik olarak, hareketlilik pencereleri ve pencere genişliği trigliseritlerin modelini takip etmelidir. Bu, DDA yöntemi kullanılarak önceki bir çalıştırma ile belirlenebilir. Dahili standartta trigliseritleri izlerken, DIA kurulumu için pencereler önceden tanımlanmış tüm ilgili molekülleri kapsamalıdır. Pencerelerin tümü eşit boyutlarda ol...

Lipid verilerini analiz ederken, kararlı izotop etiketleme (SIL), canlı organizmalardaki metabolik yolları değerlendirmek için etkili bir yöntemdir. Bu yöntemde, bir analit içindeki atomlar, 13C veya 2H içeren kararlı izotoplarla değiştirilir. Bu izotoplar ayrıca, daha sonra yağ asitlerinin içine gömülen ve bulundukları alanları etiketleyen öncülere dahil edilir. Bu izotoplarla, etiketlenmemiş arka plan1 ile kontrast oluşturacakları için lipitlerin dağılımını ve metabolizmasını tanımlayabilirsiniz. Ortak kütle spektrometresi platformları, endojen moleküllerden gelen sinyali ayırt edemez2. SIL'in başarısı, ultra yüksek çözünürlüklü analitik araçların kullanılmasını gerektirir. Yüksek çözünürlüklü tuzaklanmış iyon hareketlilik spektrometrisi-paralel birikim sıralı parçalanma-uçuş zamanı tandem kütle spektrometrisi (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi, etiketli ve etiketsiz türlerin ayrılmasına izin verir2. LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analizinin avantajı, MS sinyalinin alıkonma süresi (RT) ve hareketlilik ile filtrelenebilmesi, böylece endojen moleküllerin potansiyel girişimlerinin azaltılmasının yanı sıra istenen tüm türlerin nicelleştirilmesi ve ayrılmasıdır2. TIMS'de, bir iyon önce bir gaz-mobil faza karşı sabit tutulur ve daha sonra hareketliliğine göre serbest bırakılır. Bu, önceki IMS enstrümantasyonundan daha düşük bir voltajda çalışırken yüksek çözünürlüklü mobilogramlar sağlar3. Mobilogramlar, sürüklenme sürelerine ve örtüşme miktarına göre bileşikleri ayırt etmek için kullanılabilen, sürüklenme süresine karşı yüklenecek kütle grafikleridir4.
Ek bir PASEF tekniği kullanılarak, hassasiyetten ödün vermeden dizileme hızı büyük ölçüde artırılır5. PASEF teorisi, iyonların birikimini ve ardından hareketlilik sırasına göre sıralı salınımlarını içerir. Bu, iyonların hareketliliklerine paralel hizada birikmesiyle yapılır. Bu şekilde birikme iyon kaybını önler. Ayrıca, öncü iyon seçimi, iyonların birikmesi ve salınması ile eş zamanlı olarak gerçekleşir. Bu yöntemle PASEF, PASEF kullanmayan bir TIMS cihazının tipik özelliği olan tarama başına tek tek öncüler yerine, her TIMS taraması sırasında seri olarak birden fazla öncül seçer. Öncü iyonlar, çerçeve başına yaklaşık 2 ms'lik bir TIMS taraması içinde 100 ms'lik zirvelerde eşzamanlı olarak biriktirildiğinde ve serbest bırakıldığında, sinyal bir büyüklük sırasının üzerinde yükseltilir, bu nedenle sinyal-gürültü oranı3 artar. TIMS'e PASEF ilavesi, MS/MS'nin verimliliğini artırır. TIMS-PASEF, MS/MS ile birleştirildiği için daha verimli bir parçalanma mümkündür. Konvansiyonel MS/MS tespitinden farklı olarak, öncü sinyal TIMS-PASEF'ten sıkıştırılır ve parça iyonları, öncü3'ün TIMS elüsyon süresi ve iyon hareketliliği konumu ile aynı anda tespit edilir.
Bir kütle spektrometresinden veri alırken, istenen tarama modunda seçenekler vardır. Veriye bağlı edinim (DDA), MS1 taramasından öncü iyonları parçalamadan ve MS2 taramasını gerçekleştirmeden önce bolluklarına göre seçer. Bu tarama modu, mümkün olduğu kadar çok öncüyü parçalar. DDA yaklaşımı hedeflenmiştir ve sonuçlar iyon seçiminebağlı olacaktır 3. Bununla birlikte, DDA-PASEF genellikle replikasyonlar arasındaki tekrarlanabilirlik konusunda problemler yaşar. DDA, odaklanmış bir analizde harika bir araç olsa da, karmaşık karışımlar veri toplamada daha fazla zorluk çeker6. Bunun nedeni, aynı anda yalnızca küçük bir miktarda iyonun izlenebilmesidir3. Veriden bağımsız edinim (DIA), önceden seçilmiş m/z pencerelerinin yoğunluklarından bağımsız olarak parçalandığı ve tümünün7 aralığında tarandığı bir yöntemdir. Bu tarama modu ile, tüm iyon bulutları IMS'den kütle spektrometresi3'e iletilir. Proteomik çalışmalarda bu, DDA'ya kıyasla daha kısa bir zaman diliminde daha fazla miktarda proteinin ölçülmesine neden olur. Ek olarak, DIA, DDA'ya kıyasla daha az m/z değerini kaçırır. Bu nedenle, bu alternatif, sinyal-gürültü oranında veri tekrarlanabilirliğinde büyük gelişmeler ve DDA'dan daha iyi niceleme göstermiştir. Bu çalışmada amacımız, Tose ve ark.2 tarafından bildirilen yönteme DİA uygulamaktır. DDA ve DIA ediniminden yararlanarak biyolojik örneklerde SIL lipidlerinin mobilizasyonu, dağılımı ve metabolizması hakkında daha fazla ve daha kesin bilgi sağlayarak sinyallerin tekrarlanabilirliğini ve yoğunluğunu iyileştirdik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accucore C30 colum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27826-252130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Compass Data Analysis</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>2363525870</td>
			<td>Version 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose-13C6</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EquiSplash Lipidomix</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330731-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-417-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heavy water (2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>1.13366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene pestles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BAF199230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>L20234651907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silanized glass inserts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-251-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose-13C12</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>605417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>timsTOF</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>1.84443E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuning Mix Calibration Standard</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>36</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing de novo lipids using stable isotope labeling lc-tims-tof ms/ms

Lipitler oldukça çeşitlidir ve lipit yapılarındaki ve bileşimindeki küçük değişikliklerin kritik biyolojik işlevler üzerinde derin etkileri olabilir. Kararlı izotop etiketleme (SIL), lipid dağılımı, mobilizasyonu ve metabolizmasının yanı sıra de novo lipid sentezi çalışmaları için çeşitli avantajlar sunar. SIL tekniğinin başarılı bir şekilde uygulanması, endojen moleküllerden kaynaklanan girişimlerin giderilmesini gerektirir. Bu çalışmada, biyolojik örneklerden SIL lipidlerinin taranması için yüksek verimli bir analitik protokol tanımlanmıştır; Sivrisinek yumurtalık gelişimi sırasında lipid de novo tanımlama örnekleri gösterilecektir. Tamamlayıcı sıvı kromatografisi tuzaklı iyon hareketlilik spektrometrisi ve kütle spektrometresinin kullanılması, tek bir numuneden tek bir taramada (<1 saat) ayırma ve lipit atamasına izin verir. Açıklanan yaklaşım, hareketlilik tuzağında paralel birikimi ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışmayı kullanarak, veriye bağımlı edinim ve veriden bağımsız edinimdeki son gelişmelerden yararlanır. Yağ asidi zinciri düzeyinde SIL ölçümü, sivrisineklerin yumurtalık gelişimi sırasında lipit dinamiklerindeki değişiklikleri ortaya koymaktadır. Lipitler de novo yapıları, tutma sürelerine, hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atanır.

When analyzing lipid data, stable isotope labeling (SIL) is an effective method to assess metabolic pathways in living organisms. In this method, atoms within an analyte are replaced by stable isotopes containing 13C or 2H. These isotopes are further incorporated into precursors, which are later embedded within the fatty acids, labeling the areas in which they reside. With these isotopes, one is able to identify the distribution and metabolism of lipids, as they will contrast against the unlabeled background1. Common mass spectrometry platforms are not able to distinguish the signal coming from endogenous molecules2. The success of SIL requires the use of ultrahigh-resolution analytical tools. Liquid chromatography coupled to high-resolution trapped ion mobility spectrometry-parallel accumulation sequential fragmentation-time-of-flight tandem mass spectrometry (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) allows the separation of labeled and nonlabelled species2. The advantage of LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analysis is that the MS signal can be filtered by the retention time (RT) and mobility, thus reducing potential interferences of endogenous molecules, as well as quantification and separation of all desired species2. In TIMS, an ion is first held stationary against a gas-mobile phase and subsequently released according to its mobility. This provides high-resolution mobilograms while operating at a lower voltage than earlier IMS instrumentation3. Mobilograms are plots of mass to charge versus drift time that can be used to distinguish between compounds based off of their drift time and amount of overlap4.
By using an additional PASEF technique, sequencing speed is greatly increased without sacrificing sensitivity5. The PASEF theory involves the accumulation of ions followed by their sequential release in the order of their mobility. This is done by accumulating ions in parallel alignment to their mobility. The accumulation in this fashion prevents ion loss. Furthermore, the precursor ion selection occurs simultaneously with the accumulation and release of the ions. With this method, PASEF selects multiple precursors in series during each TIMS scan, rather than the individual precursors per scan typical of a TIMS instrument that does not use PASEF. When the precursor ions are concurrently accumulated and released in 2 ms peaks within a TIMS scan of approximately 100 ms per frame, the signal is amplified by over one order of magnitude, therefore increasing the signal-to-noise ratio3. The PASEF addition to the TIMS increases the efficiency of the MS/MS. As the TIMS-PASEF is coupled with MS/MS, a more efficient fragmentation is possible. Unlike conventional MS/MS detection, the precursor signal is compressed from the TIMS-PASEF, and the fragment ions are detected simultaneously to the TIMS elution time and ion mobility position of the precursor3.
When acquiring data from a mass spectrometer, there are options in the scan mode desired. Data dependent acquisition (DDA) selects precursor ions from the MS1 scan based on their abundances, before fragmenting them and performing the MS2 scan. This scan mode fragments as many precursors as possible. The DDA approach is targeted, and results will depend on the ion selection3. However, DDA-PASEF often has problems in the reproducibility between replicates. While DDA is a great tool in a focused analysis, complex mixtures have greater difficulty in their data acquisition6. This is because only a small amount of ions can be monitored simultaneously3. Data independent acquisition (DIA) is a method where preselected windows of m/z are fragmented independently from their intensity, and all are scanned within the range7. With this scan mode, entire ion clouds are transmitted from the IMS to the mass spectrometer3. In proteomics studies this results in greater amounts of proteins being quantified in a shorter time span compared to DDA. In addition, DIA misses fewer m/z values compared to DDA. Therefore, this alternative has shown great improvements in data reproducibility in signal to noise ratio and better quantification than DDA. In this present work, our goal is to implement DIA to the method reported by Tose et al.2. We improved the reproducibility and intensity of signals, yielding further and more conclusive information on SIL lipids mobilization, distribution and metabolism in biological samples taking advantage of DDA and DIA acquisition.

Yazar Spotlight: Kararlı İzotop Etiketleme Kullanılarak Karmaşık Lipidomik Numunelerin Miktar Tayini

Kararlı İzotop Etiketleme LC-TIMS-TOF MS/MS kullanarak de novo Lipidlerin İzlenmesi

This research intends to implement more specific quantification in lipidomic samples using stable isotope labeling. This allows us to understand lipid panels and highly diverse samples from insects to humans. There currently is a gap in this field regarding the standardization of LC, TIMS, Top, MS/MS in lipidomic investigations.Here we provide a method for tracking biomass remains for this purpose. In the future, our research will involve the investigation of epigenetics and metabolomics present in the biological process using the LC team staff, MS/MS, involve DDA and DIA methods.

Kararlı izotop etiketlemesi, dişi sivrisinek yumurtalıklarının lipid dinamiği çalışmalarında trigliseritlerin görselleştirilmesini kolaylaştırır. 2D mobilite alanında, trigliserid 48:1, mobilite 1/K0 ile ilgili olarak belirli bir alıkonma süresine sahip bir bölgede görüntülenir. Trigliseridin yoğunluğu daha koyu mavi bir çizgi ile görselleştirilebilir. Diğer noktalar, yumurtalık içinde bulunan ek trigliseritleri temsil eder. Tutma süreleri ve hareketlilikleri, kütle ve yapılard...

Burada sunulan, alıkonma sürelerini, hareketliliklerini ve parçalanmalarını kullanarak kararlı izotop etiketleme yoluyla lipid yapılarını taramak için bir yöntemdir.

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

Bu araştırma, kararlı izotop etiketlemesi kullanılarak lipidomik numunelerde daha spesifik miktar tayini gerçekleştirmeyi amaçlamaktadır. Bu, lipid panellerini ve böceklerden insanlara kadar çok çeşitli örnekleri anlamamızı sağlar. Şu anda bu alanda lipidomik araştırmalarda LLC, TIMS, TOP, MS/MS'nin standardizasyonu ile ilgili bir boşluk bulunmaktadır.Burada, bu amaç için biyokütle kalıntılarını izlemek için bir yöntem sunuyoruz. Gelecekte, araştırmamız, LC ekip personeli, MS / MS, DDA ve DIA yöntemlerini içeren biyolojik süreçte mevcut olan epigenetik ve metabolomiklerin araştırılmasını içerecektir.

tracing-de-novo-lipids-using-stable-isotope-labeling-lc-tims-tof-msms

Research

JoVE Journal

Chemistry

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

711 Görüntüleme.  Florida International University. Bu araştırma, kararlı izotop etiketlemesi kullanılarak lipidomik numunelerde daha spesifik miktar tayini gerçekleştirmeyi amaçlamaktadır. Bu, lipid panellerini ve böceklerden insanlara kadar çok çeşitli örnekleri anlamamızı sağlar. Şu anda bu alanda lipidomik araştırmalarda LLC, TIMS, TOP, MS/MS'nin standardizasyonu ile ilgili bir boşluk bulunmaktadır.Burada, bu amaç için biyokütle kalıntılarını izlemek için bir yöntem sunuyoruz. Gelecekte, araştırmamız...