המחברים אוהבים להכיר בתרומתו של ד"ר סזאר רמירז במהלך פיתוחי השיטה הראשוניים. מחקר זה מומן על ידי מענקי NIAID R21AI167849 FGN, פרויקט 22-21244S מקרן המדע הצ'כית, צ'כיה למינסוטה.

1. הכנת מדגם
<ol><li>נתיחת חרקים<ol><li>לנתח שחלות יתוש Aedes aegypti כאשר הם בני 7 ימים בתמיסת מלח חוצצת פוספט באמצעות מיקרו-מחטים.</li>
		<li>לאסוף שמונה שחלות מתמיסת מלח חוצצת פוספט באמצעות מיקרו-מחטים ולאחסן בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של -80°C.</li>
		<li>לאסוף שחלות בשכפולים ביולוגיים.</li>
	</ol></li>
	<li>מיצוי שומנים<ol><li>הוסף 10 μL של תקן פנימי (ISTD) לשמונה השחלות שנאספו בריכוז של 1 ppm. ISTD היא תערובת שומנים מסומנת עם שבעה דאוטריום של 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine-D7 (15: 0-18:1 (D7) PC), lysophosphatidylcholine-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl-glycero-3-phosphoethanolamine-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glycerol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glycerol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-octadecenoyl-sn-glycerol-D7 (18:1 MAG (D7)), cholesteryl oleate-D7 (18:1 (D7) Chol Ester).</li>
		<li>יש להמתין עד לייבוש בטמפרטורת החדר. הוסף 100 μL של butanol/מתנול ו 3 μL של hydroxytoluene butylated. הומוגניזציה ידנית במשך 10 שניות עם 1.5 מ"ל פוליפרופילן מזיקים.</li>
		<li>שטפו את המזיק עם 200 מיקרוליטר בוטנול/מתנול ושלבו עם התמיסה ההומוגנית.</li>
		<li>הפעל את צינור המיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ובעוצמה בינונית למשך 30 דקות.</li>
		<li>צינורות צנטריפוגה ב 1600 x גרם במשך 10 דקות ב 20 ° C. מעבירים את הסופרנאטנט לבקבוקון דוגמים אוטומטי עם 300 מיקרוליטר של תוספות זכוכית סילניות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הגדרת מכשירים
<ol><li>הכנת שלב המובייל<ol><li>הכן שלב נייד עם הרכב של 30:40:30 (שלב נייד A) ו- 10:5:85 (שלב B נייד) באמצעות אצטוניטריל, מים ואיזופרופנול כיחס המתאים. בשני השלבים הניידים, הוסף פורמט אמוניום 10 mmol / L במים ו- 0.1% חומצה פורמית כדי ליצור מצב חיץ.</li>
		<li>שוקלים 3.15 גרם של פורמט אמוניום ב 10 מ"ל של מים. הוסף 500 μL של פתרון זה ב 12.5 מ"ל של מים. ברצף, לשים לתוך בקבוק נפח 250 מ"ל ולמלא isopropanol על 2/3 של הצלוחית. מערבבים על ידי ערבול.</li>
		<li>מוסיפים 250 מיקרוליטר חומצה פורמית (85%), ממלאים ב-25 מ"ל אצטוניטריל ואיזופרופנול לקו מילוי של 250 מ"ל, ומערבבים.</li>
	</ol></li>
	<li>במערכת MS, בצד שמאל של המסך בהגדרות MS, קבע את טווח המסה על ידי בחירת 50 כמינימום ו- 1850 כהגדרת הסריקה המקסימלית.<ol><li>בחר Polarity כמצב יונים חיובי. בחר במצב סריקה כ - DIA-PASEF. לשם כך, בחר כוונון ושיטת ניתוח פתוחה משיטת DDA קודמת עם פרמטרי LC הבאים.<ol><li>להפרדת מעבר צבע: הזרקת דגימה: 0% B, זמן המתנה 1 דקה. להגדיל ל-55% B, להחזיק עד 6.4 דקות. להגדיל ל-65% B, להחזיק עד 24 דקות. להגדיל ל 88% B, להחזיק עד 40.8 דקות. להגדיל ל-95% B, להחזיק עד 48.1 דקות. מנמיכים ל-35% B, מחזיקים עד 56 דקות. הפחיתו ל-0% B, החזיקו עד 60 דקות.</li>
			<li>עבור תנאי HPLC: נפח הזרקה: 5 μL קצב ממס: 0.25 מ"ל/דקה זמן פעולה כולל: 60 דקות, בהן 5 דקות הן להתנות מראש את העמודה.</li>
			<li>הכן את הכרומטוגרף הנוזלי על ידי הכנסת העמודה לכרומטוגרף הנוזלי. הפעל ריק כדי לנקות את העמודה ולבדוק אם יש נזילות. ניתן לראות זאת בכך שהמכשיר אינו מחזיק לחץ או זרימה.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>כדי ליצור שיטה חדשה, בצע את השלבים המתוארים להלן (תרשים 1 ו תרשים 2).<ol><li>פתח את התוכנה ולחץ על חבר את כל המכשירים. אם החיבור מצליח, מערכת LC תצפצף פעם אחת, ומסך הבקרה מפרט את HyStar בתיבה מצב ללא הודעות שגיאה.</li>
		<li>לחץ על הכרטיסייה רכישה . ב- Sample Table Navigator, אתר את התפריט הנפתח Tag ובחר שיטה קודמת.</li>
		<li>הכפילו את טבלת הדוגמאות העדכנית ביותר. לחץ על שמירה בשם... ושמור רשימה חדשה לדוגמה עם הפורמט: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) כאשר (XXXX) הוא תיאור קצר של הניתוח.</li>
		<li>לחצו לחיצה ימנית על שיטת ההפרדה ולחצו על עריכת שיטה. לחץ על ערוך שיטת מודול.</li>
		<li>לחץ על הורד. אם תצליח, ההורדה הצליחה תופיע. סגור את המסך ללא שיטת שמירה.</li>
		<li>תחת הגדרות MS עבור אל הגדרות TIMS, בחר את 1/k0 להתחיל ב- 0.70 ו- 1/k0 להסתיים ב- 1.85. הגדר את זמן הרמפה ל- 150 אלפיות השנייה. עם זאת, מחזור העבודה ואת קצב הרמפה מותאמים באופן אוטומטי.</li>
		<li>בחלון התחתון, בחר בכרטיסיה מקור . בחר את סוג המקור כ - ESI והגדר את הסטת לוח הקצה ל- 800 V ואת הנימים ל- 4500 V. סמן את תיבת הנבולייזר והגדר את הלחץ ל- 4.0 בר. כוונו את הגז היבש ל-4.0 ליטר/דקה ואת הטמפרטורה היבשה ל-250°C.</li>
		<li>משמאל לכרטיסיית המקור, בחר בכרטיסיה כוונון. לחץ על הכרטיסיה משנה כללית ותחת כותרת ההעברה ודא את הפרמטרים הבאים: סטייה 1 דלתא: 70 V משפך 1 RF: 250 vpp אנרגיית isCID: 0 eV משפך 2 RF: 250 vpp RF רב-קוטבי: 500 vpp.<ol><li>תחת הכותרת תא התנגשות ודא את הפרמטרים הבאים: אנרגיית התנגשות: 6.0 eV התנגשות RF: 1200 vpp.</li>
			<li>תחת הכותרת quadrupole ודא את הפרמטרים הבאים: אנרגיית יונים: 6 eV משקל נמוך: 250 m/z.</li>
			<li>תחת הכרטיסייה מיקוד טרום TOF ודא את הפרמטרים הבאים: זמן העברה: 45 μs אחסון טרום פולס: 5.0 μs.</li>
		</ol></li>
		<li>לחץ על הכרטיסיה משנה עיבוד . תחת גילוי שיא ספקטרום מסה ודא את הפרמטרים הבאים: סף מוחלט: 667 סף מוחלט (לכל 100 אלפיות השנייה AccuTime): 445.<ol><li>תחת זיהוי שיא ניידות ודא את הפרמטרים הבאים: סף מוחלט: 30.00.</li>
		</ol></li>
		<li>לחץ על כרטיסיית המשנה TIMS . תחת הכרטיסייה קיזוזים, ודא את הפרמטרים הבאים: Δt1: -20 V Δt2: -150 V Δt3: 70 V Δt4: 150 V Δt5: 0 V Δt6: 150 V תא התנגשות: 300 V.</li>
		<li>משמאל לכרטיסיית הכוונון, לחץ על הכרטיסיה MS/MS . תחת הכרטיסייה יונים מקדימים, ודא את הפרמטרים הבאים: מספר רמפות PASEF: 8 מינימום טעינה: 1 טעינה מקסימלית:1.<ol><li>תחת הכרטיסיה תזמון, לחץ על מתקדם וודא את הפרמטרים הבאים: עוצמות: 0,1500, 5000, 10000 חזרות: 1, 10, 5, 1 סף עצימות: 1500.</li>
			<li>תחת הכרטיסייה אי-הכללה פעילה, ודא את הפרמטרים הבאים: סימן ביקורת פעיל של אי-הכללה שחרור אחרי: 0.4 דקות</li>
			<li>תחת הגדרות אנרגיית התנגשות ודא את הפרמטרים הבאים: K0 (V-s/cm3): 0.70, 1.60 אנרגיית התנגשות (eV): 20.00, 35.00.</li>
			<li>תחת הגדרות רוחב בידוד ודא את הפרמטרים הבאים: מסה (m/z): 622, 1222 רוחב (m/z): 1.00 2.50.</li>
		</ol></li>
		<li>הגדרת DIA -PASEF: בחר DIA-PASEF ממצב סריקת הגדרות MS בצד שמאל. תחת הכרטיסיה MS/MS, בחר Window Editor. כאן, ודא את הפרמטרים הבאים (איור 3): הגדרות חלון: רוחב מסה: 50 Da; חפיפה המונית: 0.0 Da; חישוב מצולע: צעדים המוניים; מספר חלונות ניידות: 1.</li>
	</ol></li>
</ol>3. כיול
<ol><li>כיול מכשירים (איור 4)<ol><li>תחת הכרטיסייה משנה כיול לחץ על m/z, בחר Tuning Mix מתיבת השחרור ולחץ כיול בפינה השמאלית התחתונה.</li>
		<li>המשך ללחוץ על כיול עד להשגת ציון של 100%.</li>
		<li>כעת בחר בכרטיסיה ניידות ובצע את אותם השלבים שתוארו לעיל עד שתגיע לציון הכיול של 100%.</li>
	</ol></li>
	<li>עקומת כיול<ol><li>ספייק תערובת סטנדרטית פנימית של שומנים עם 10 μL של תערובת סטנדרטית פנימית מפורקת. השתמש בשבע נקודות כיול מ- 0.1-500 ננוגרם/מ"ל של תערובת סטנדרטית עם 10 מיקרוליטר של התערובת הסטנדרטית הפנימית המפורקת.</li>
		<li>הוסף ביאורים ידניים לשרשראות חומצות השומן המבוססות על תבניות PASEF MS/MS שכבר תוארוב-2.</li>
	</ol></li>
	<li>יעילות התוויה SIL<ol><li>חשב את היחס בין שטח האיזוטופים המכילים SIL לשטח האיזוטופים שאינם מכילים SIL.</li>
		<li>חישוב הטפיחה התיאורטית על ידי קביעת ההסתברות למצוא אטום מסומן בכל אתר.</li>
		<li>חישוב העשרת SIL על ידי התאמת פרופילי האיזוטופים הניסיוניים לתבנית התיאורטית המדומה בתוכנת ניתוח נתונים.</li>
	</ol></li>
	<li>התחלת הריצה<ol><li>הפעל תנור עמודים על ידי לחיצה על כפתור המדחום . הפעל משאבות על ידי לחיצה על כפתור שסתום .</li>
		<li>הגדר את שיטת MS לשיטה שנשמרה קודם לכן. ודא שנפח ההזרקה הוא 5 μL ושקו 1 יכוון לבקבוקון 20:1.</li>
		<li>ודא שבקבוקון 20:1 מכיל 50% IPA/ACN. שמור רשימה לדוגמה.</li>
		<li>התחל רצף וודא שבוצעה הזרקה מוצלחת (אושר על ידי הודעה המוצגת במערכת המציינת מוזרק).</li>
		<li>העתק את שורה 1 והדבק למטה כדי ליצור שורה חדשה. אכלס את קו 2 בדגימות בהתאם לניסוי הנוכחי. ודא שנעשה שימוש במיקום הנכון בדוגם האוטומטי.</li>
		<li>אם השלב הנייד טרי, בצע תחילה בדיקת צורת שיא על ידי הזרקת תקני תערובת השומנים מהיצרן. השווה עם תוצאות קודמות. 2 התקנים הם תערובת שומנים של 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (15: 0-18: 1 PC), lysophosphatidylcholine (18: 1 Lyso PC), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl-glycero-3-phosphoethanolamine (15: 0-18: 1 PE), 1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (18: 1 Lyso PE), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (15: 0-18: 1 PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (15: 0-18: 1 PS), 1,2- dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glycerol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glycerol (15:0-18:1 DAG), 2-octadecenoyl-sn-glycerol (18:1 MAG), cholesteryl oleate (18: 1 Chol Ester).</li>
		<li>ודא שלקווים חדשים יש את שיטת ההפרדה הנכונה ולא את שיטת ההתניה מראש הנהוגה בשורה 1. ודא כי שיטת MS נכונה (השיטה של היום הנוכחי).</li>
		<li>ודא ששיטת העיבוד הנכונה נטענת ושהאפשרות הפעל תהליך אוטומטי מופעלת.</li>
		<li>שמור רשימה לדוגמה כדי לוודא שדוגמאות ינותחו לאחר סיום ההפעלה הנוכחית.</li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>תוכנה פתוחה לניתוח נתונים (איור 5). בפינה השמאלית העליונה לחץ על קובץ כפתור ובחר פתח ...</li>
	<li>בחר את הקבצים הנבחרים. לחץ לחיצה ימנית על שם הקובץ ובחר מאפיינים.<ol><li>בחר מצב כיול (איור 6). בתיבה הנפתחת, בחר כיול ראשוני עבור ספקטרומטר המסות. ודא שכל השגיאות קטנות מ- 1 עמודים לדקה.</li>
		<li>לאחר מכן, בחר כיול ניידות ראשוני ואשר שהשגיאה קטנה מ- 1 עמודים לדקה.</li>
		<li>לחץ לחיצה ימנית על כרומטוגרמה ובחר ערוך כרומטוגרמה (איור 6C). תחת סוג, לחץ על התיבה הנפתחת ובחר כרומטוגרמה של יונים שחולצו (איור 6D). תחת סינון, בחר כל MS ובמצב סריקה בחר הכל. זאת כדי לראות את הפסגות של המולקולה המעניינת ולא רק את השברים שלה.<ol><li>מתחת לזה, יש שתי אפשרויות סינון לבחירת מולקולות: מסות או נוסחה. אם בוחרים מסות , אפשר לבחור את ה-m/z התיאורטי של המולקולות המעניינות. במקרה זה, בחר 829.7985 m/z. אם נבחרה פורמולה , ניתן לבחור את הנוסחה עבור המולקולה, כמו גם את צורות היונים המעניינות את הכרומטוגרמה. במקרה זה, בחר אמוניום [M+NH4]. הסיבה לכך היא חיץ האמוניום בשלב הנייד שיעדיף יינון בצורת יונים זו (איור 7).</li>
			<li>בתיבה width, בחר ±1. עבור קוטביות להבטיח כי הוא שומר על מצב חיובי. תחת ניידות, בחר 1.455-1.465. זה נעשה כדי לסנן את כל המולקולות שאינן נופלות בתוך ערכים אלה ולבודד את המולקולה של עניין.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>לאחר בחירת הפרמטרים, לחץ על הוסף > אישור בפינה השמאלית העליונה. לאחר פרק זמן קצר, התוכנה תעבד את הבחירות ותפיק כרומטוגרמה.</li>
	<li>לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על קו הבסיס בתחילת שיא העניין וגרור תוך כדי החזקה לסוף הפסגה. אינטגרציה ידנית זו תספק ספקטרום מסה חי של מקטעים בתוך זמן שמירה זה.</li>
	<li>מובילוגרמה<ol><li>לחץ לחיצה ימנית בצד שמאל של המסך ב - Mobilogram ובחר Edit Mobilogram (איור 8). יופיע חלון בשם Edit Mobilogram Traces. בצעו את אותם השלבים C.e.i.1 עד C.e.i.5 (איור 9).</li>
		<li>בזמן השמירה הזן את זמן השמירה של שיא הריבית. במקרה זה, 37.45-37.55 דקות.</li>
		<li>לאחר בחירת הפרמטרים, לחץ על הוסף > אישור בפינה השמאלית העליונה. לאחר פרק זמן קצר, התוכנה תעבד את הבחירות ותפיק כרומטוגרמה.</li>
	</ol></li>
	<li>עבור יונים שחולצו, חזור על שלבים 4.2.3.1-4.3.2.2 עד ליצירת רשימה של יונים.</li>
	<li>בחלק התחתון של חלון MS, בחר פרופיל MS ו פרגמנט MS. זה יאפשר מבט ספקטרום של יונים מסריקה מלאה ו- PASEF.<ol><li>בתצוגת ספקטרום, לחץ לחיצה ימנית ובחר העתק ספקטרום מורכב. בעזרת נתוני הספקטרום המופיעים מימין, ניתן למצוא מידע נוסף על התרכובת כגון רזולוציה המספקת עוצמה, עוצמה ויחס אות לרעש (S/N; איור 10).</li>
	</ol></li>
	<li>עיבוד<ol><li>כדי לעבד את הנתונים, שלבו ידנית את שיאי הכרומטוגרמה והניידות כדי להפיק מידע רב ערך על המולקולה המעניינת (איור 10).</li>
		<li>לחץ לחיצה ימנית על חפש ובחר שלב רק כרומטוגרמה או ניידות (איור 11). לחץ לחיצה שמאלית וסמן את הפסגה הרצויה. מידע זה כולל זמן שמירה, אזור, S/N וניידות.</li>
	</ol></li>
</ol>

סינון מבני שומנים באמצעות תיוג איזוטופים יציבים

<ol>
	<li>Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotopically+labeled+internal+standards+in+quantitative+bioanalysis+using+liquid+chromatography/mass+spectrometry:+Necessity+or+not.">Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).</li><li>Tose, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+stable+isotope+labeling+and+liquid+chromatography-trapped+ion+mobility+spectrometry-time-of-flight-tandem+mass+spectrometry+for+de+novo+mosquito+ovarian+lipid+studies.">Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies.</a> Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).</li><li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics.">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).</li><li>Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+enhances+low-abundance+species+detection+in+untargeted+lipidomics.">Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics.</a> Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+parallel+accumulation-serial+fragmentation+(PASEF)+with+a+novel+trapped+ion+mobility+mass+spectrometer.">Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li><li>Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometric+approaches:+DIA,+WiSIM-DIA,+and+untargeted+DIA.">Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA.</a> Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+identification+strategy+on+the+reproducibility+of+the+DDA+and+DIA+results.">Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results.</a> J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).</li><li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+data+acquisition+and+processing+strategies+with+increased+throughput+and+selectivity:+PSMART+analysis+for+global+qualitative+and+quantitative+analysis.">Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).</li><li>Tsou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIA-umpire:+Comprehensive+computational+framework+for+data-independent+acquisition+proteomics.">DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics.</a> Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).</li><li>Triebl, A., Wenk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+considerations+of+stable+isotope+labelling+in+lipidomics.">Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics.</a> Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).</li></ol>

מתיו ווילטס ומלווין א. פארק הם עובדים של Bruker Daltonics Inc, יצרנית המכשיר המסחרי timsTOF. המחברים מצהירים כי אין אינטרס כלכלי מתחרה.

בעת הערכת השימוש בפרוטוקול זה, חיוני לוודא שהפרמטרים DIA-PASEF ו- MS/MS ישימים לטריגליצרידים המדוברים. באופן ספציפי, חלונות ניידות רוחב החלון צריך לעקוב אחר דפוס של טריגליצרידים. ניתן לקבוע זאת באמצעות הפעלה קודמת בשיטת DDA. בעת מעקב אחר הטריגליצרידים בתקן הפנימי, החלונות להגדרת DIA צריכים לכסות את...

בעת ניתוח נתוני שומנים, תיוג איזוטופים יציבים (SIL) הוא שיטה יעילה להערכת מסלולים מטבוליים באורגניזמים חיים. בשיטה זו, אטומים בתוך אנליט מוחלפים על ידי איזוטופים יציבים המכילים 13C או 2H. איזוטופים אלה משולבים עוד יותר בקודמנים, אשר מוטמעים מאוחר יותר בתוך חומצות השומן, ומסמנים את האזורים שבהם הם שוכנים. עם איזוטופים אלה, ניתן לזהות את התפלגות ומטבוליזם של שומנים, כפי שהם יהיו בניגוד לרקע ללא תווית1. פלטפורמות ספקטרומטריית מסות נפוצות אינן מסוגלות להבחין בין האות המגיע ממולקולות אנדוגניות2. ההצלחה של SIL דורשת שימוש בכלים אנליטיים ברזולוציה גבוהה במיוחד. כרומטוגרפיה נוזלית המצומדת לספקטרומטריית ניידות יונים לכודים ברזולוציה גבוהה-צבירה מקבילית, ספקטרומטריית מסה טנדם רציפה של פיצול רציף-זמן-טיסה (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) מאפשרת הפרדה בין מינים מסומנים ללא מסומנים2. היתרון של ניתוח LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS הוא שניתן לסנן את אות הטרשת הנפוצה לפי זמן השמירה (RT) והניידות, ובכך להפחית הפרעות פוטנציאליות של מולקולות אנדוגניות, כמו גם כימות והפרדה של כל המינים הרצויים2. ב-TIMS, יון מוחזק תחילה במצב נייח כנגד פאזה ניידת גז ולאחר מכן משוחרר בהתאם לניידות שלו. זה מספק ניידות ברזולוציה גבוהה תוך פעולה במתח נמוך יותר מאשר מכשור IMS מוקדם יותר3. מובילוגרמות הן חלקות של מסה לטעינה לעומת זמן סחף שניתן להשתמש בהן כדי להבחין בין תרכובות בהתבסס על זמן הסחף שלהן וכמות החפיפה שלהן4.
על ידי שימוש בטכניקת PASEF נוספת, מהירות הרצף גדלה מאוד מבלי להקריב את רגישות5. תאוריית PASEF כוללת הצטברות של יונים ואחריה שחרורם הרציף לפי סדר ניידותם. זה נעשה על ידי צבירת יונים ביישור מקביל לניידות שלהם. ההצטברות באופן זה מונעת אובדן יונים. יתר על כן, בחירת היונים המקדימים מתרחשת בו זמנית עם הצטברות ושחרור היונים. בשיטה זו, PASEF בוחר מבשרי סדרה מרובים במהלך כל סריקת TIMS, במקום קודמנים בודדים לכל סריקה האופייניים למכשיר TIMS שאינו משתמש ב- PASEF. כאשר היונים המקדימים מצטברים בו זמנית ומשוחררים בפסגות של 2 אלפיות השנייה בסריקת TIMS של כ-100 מילישניות לפריים, האות מוגבר ביותר מסדר גודל אחד, ובכך מגדיל את יחס האות לרעש3. תוספת PASEF ל- TIMS מגבירה את היעילות של MS/MS. מכיוון ש-TIMS-PASEF משולב עם MS/MS, פיצול יעיל יותר אפשרי. שלא כמו זיהוי MS/MS קונבנציונלי, האות המקדים נדחס מה-TIMS-PASEF, ויוני השבר מזוהים בו זמנית לזמן האלוציה של TIMS ולמיקום ניידות היונים של קודמן3.
בעת רכישת נתונים מספקטרומטר מסות, ישנן אפשרויות במצב הסריקה הרצוי. רכישה תלוית נתונים (DDA) בוחרת יונים מקדימים מסריקת MS1 בהתבסס על השפע שלהם, לפני פיצול שלהם וביצוע סריקת MS2. מצב סריקה זה מקטעים כמה שיותר סימנים מקדימים. גישת DDA ממוקדת, והתוצאות יהיו תלויות בבחירת היונים3. עם זאת, DDA-PASEF לעתים קרובות יש בעיות ביכולת השחזור בין משכפלים. בעוד DDA הוא כלי נהדר בניתוח ממוקד, תערובות מורכבות יש קושי גדול יותר ברכישת הנתונים שלהם6. הסיבה לכך היא שרק כמות קטנה של יונים ניתן לנטר בו זמנית3. רכישה עצמאית של נתונים (DIA) היא שיטה שבה חלונות m/z שנבחרו מראש מפוצלים בנפרד מעוצמתם, וכולם נסרקים בטווח7. במצב סריקה זה, ענני יונים שלמים משודרים מה-IMS לספקטרומטר המסות3. במחקרי פרוטאומיקה התוצאה היא שכמויות גדולות יותר של חלבונים מכומתות בטווח זמן קצר יותר בהשוואה ל-DDA. בנוסף, DIA מחמיץ פחות ערכי m/z בהשוואה ל- DDA. לכן, חלופה זו הראתה שיפורים גדולים ביכולת שחזור הנתונים ביחס אות לרעש וכימות טוב יותר מאשר DDA. בעבודה הנוכחית מטרתנו היא ליישם DIA בשיטה שדווחה על ידי Tose et al.2. שיפרנו את יכולת השחזור והעוצמה של אותות, והפקנו מידע נוסף וחד משמעי יותר על ניוד, הפצה ומטבוליזם של שומנים ב-SIL בדגימות ביולוגיות תוך ניצול רכישת DDA ו-DIA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accucore C30 colum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27826-252130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Compass Data Analysis</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>2363525870</td>
			<td>Version 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose-13C6</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EquiSplash Lipidomix</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330731-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-417-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heavy water (2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>1.13366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene pestles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BAF199230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>L20234651907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silanized glass inserts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-251-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose-13C12</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>605417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>timsTOF</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>1.84443E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuning Mix Calibration Standard</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>36</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing de novo lipids using stable isotope labeling lc-tims-tof ms/ms

שומנים הם מגוונים מאוד, ושינויים קטנים במבנה השומנים ובהרכבם יכולים להיות בעלי השפעות עמוקות על תפקודים ביולוגיים קריטיים. תיוג איזוטופים יציבים (SIL) מציע מספר יתרונות לחקר פיזור השומנים, ניודיזציה ומטבוליזם, כמו גם סינתזת שומנים דה נובו . היישום המוצלח של טכניקת SIL דורש הסרת הפרעות ממולקולות אנדוגניות. בעבודה הנוכחית אנו מתארים פרוטוקול אנליטי בתפוקה גבוהה לבדיקת שומנים SIL מדגימות ביולוגיות; יוצגו דוגמאות לזיהוי שומנים דה נובו במהלך התפתחות שחלות יתושים. השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית משלימה, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה מאפשר הפרדה והקצאת שומנים מדגימה בודדת בסריקה אחת (<1 שעות). הגישה המתוארת מנצלת את ההתפתחויות האחרונות ברכישה תלוית נתונים ורכישה בלתי תלויה בנתונים, תוך שימוש בצבירה מקבילית במלכודת הניידות ואחריה פיצול רציף ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות. מדידת SIL ברמת שרשרת חומצות השומן מגלה שינויים בדינמיקה של שומנים במהלך התפתחות השחלה של יתושים. מבני השומנים דה נובו מוקצים בביטחון בהתבסס על זמן השמירה שלהם, ניידות ודפוס הפיצול שלהם.

When analyzing lipid data, stable isotope labeling (SIL) is an effective method to assess metabolic pathways in living organisms. In this method, atoms within an analyte are replaced by stable isotopes containing 13C or 2H. These isotopes are further incorporated into precursors, which are later embedded within the fatty acids, labeling the areas in which they reside. With these isotopes, one is able to identify the distribution and metabolism of lipids, as they will contrast against the unlabeled background1. Common mass spectrometry platforms are not able to distinguish the signal coming from endogenous molecules2. The success of SIL requires the use of ultrahigh-resolution analytical tools. Liquid chromatography coupled to high-resolution trapped ion mobility spectrometry-parallel accumulation sequential fragmentation-time-of-flight tandem mass spectrometry (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) allows the separation of labeled and nonlabelled species2. The advantage of LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analysis is that the MS signal can be filtered by the retention time (RT) and mobility, thus reducing potential interferences of endogenous molecules, as well as quantification and separation of all desired species2. In TIMS, an ion is first held stationary against a gas-mobile phase and subsequently released according to its mobility. This provides high-resolution mobilograms while operating at a lower voltage than earlier IMS instrumentation3. Mobilograms are plots of mass to charge versus drift time that can be used to distinguish between compounds based off of their drift time and amount of overlap4.
By using an additional PASEF technique, sequencing speed is greatly increased without sacrificing sensitivity5. The PASEF theory involves the accumulation of ions followed by their sequential release in the order of their mobility. This is done by accumulating ions in parallel alignment to their mobility. The accumulation in this fashion prevents ion loss. Furthermore, the precursor ion selection occurs simultaneously with the accumulation and release of the ions. With this method, PASEF selects multiple precursors in series during each TIMS scan, rather than the individual precursors per scan typical of a TIMS instrument that does not use PASEF. When the precursor ions are concurrently accumulated and released in 2 ms peaks within a TIMS scan of approximately 100 ms per frame, the signal is amplified by over one order of magnitude, therefore increasing the signal-to-noise ratio3. The PASEF addition to the TIMS increases the efficiency of the MS/MS. As the TIMS-PASEF is coupled with MS/MS, a more efficient fragmentation is possible. Unlike conventional MS/MS detection, the precursor signal is compressed from the TIMS-PASEF, and the fragment ions are detected simultaneously to the TIMS elution time and ion mobility position of the precursor3.
When acquiring data from a mass spectrometer, there are options in the scan mode desired. Data dependent acquisition (DDA) selects precursor ions from the MS1 scan based on their abundances, before fragmenting them and performing the MS2 scan. This scan mode fragments as many precursors as possible. The DDA approach is targeted, and results will depend on the ion selection3. However, DDA-PASEF often has problems in the reproducibility between replicates. While DDA is a great tool in a focused analysis, complex mixtures have greater difficulty in their data acquisition6. This is because only a small amount of ions can be monitored simultaneously3. Data independent acquisition (DIA) is a method where preselected windows of m/z are fragmented independently from their intensity, and all are scanned within the range7. With this scan mode, entire ion clouds are transmitted from the IMS to the mass spectrometer3. In proteomics studies this results in greater amounts of proteins being quantified in a shorter time span compared to DDA. In addition, DIA misses fewer m/z values compared to DDA. Therefore, this alternative has shown great improvements in data reproducibility in signal to noise ratio and better quantification than DDA. In this present work, our goal is to implement DIA to the method reported by Tose et al.2. We improved the reproducibility and intensity of signals, yielding further and more conclusive information on SIL lipids mobilization, distribution and metabolism in biological samples taking advantage of DDA and DIA acquisition.

Author Spotlight: כימות דגימות ליפידומיות מורכבות באמצעות תיוג איזוטופים יציבים

מעקב אחר ליפידים של נובו באמצעות תיוג איזוטופ יציב LC-TIMS-TOF MS/MS

This research intends to implement more specific quantification in lipidomic samples using stable isotope labeling. This allows us to understand lipid panels and highly diverse samples from insects to humans. There currently is a gap in this field regarding the standardization of LC, TIMS, Top, MS/MS in lipidomic investigations.Here we provide a method for tracking biomass remains for this purpose. In the future, our research will involve the investigation of epigenetics and metabolomics present in the biological process using the LC team staff, MS/MS, involve DDA and DIA methods.

תיוג האיזוטופ היציב מאפשר הדמיה של טריגליצרידים במחקרי דינמיקת שומנים של שחלות יתושים נקבות. בתחום הניידות הדו-ממדית, הטריגליצרידים 48:1 מוצגים באזור עם זמן שמירה ספציפי ביחס לניידות 1/K0. את עוצמת הטריגליצרידים ניתן לדמיין על ידי קו כחול כהה יותר. כתמים אחרים מייצגים טריגליצרידים נוס?...

מוצגת כאן שיטה לסינון מבני שומנים באמצעות תיוג איזוטופים יציבים באמצעות זמן השמירה, הניידות והפיצול שלהם.

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

מחקר זה מתכוון ליישם כימות ספציפי יותר בדגימות ליפידומיות באמצעות תיוג איזוטופים יציבים. זה מאפשר לנו להבין לוחות שומנים ודגימות מגוונות מאוד מחרקים ועד בני אדם. כיום קיים פער בתחום זה בנוגע לסטנדרטיזציה של LC, TIMS, Top, MS/MS בחקירות ליפידומיות.כאן אנו מספקים שיטה למעקב אחר שרידי ביומסה למטרה זו. בעתיד, המחקר שלנו יכלול חקירה של אפיגנטיקה ומטבולומיקה הקיימת בתהליך הביולוגי באמצעות צוות צוות LC, MS/MS, בשיטות DDA ו- DIA.

tracing-de-novo-lipids-using-stable-isotope-labeling-lc-tims-tof-msms

Research

JoVE Journal

Chemistry

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

748 Views.  Florida International University. מחקר זה מתכוון ליישם כימות ספציפי יותר בדגימות ליפידומיות באמצעות תיוג איזוטופים יציבים. זה מאפשר לנו להבין לוחות שומנים ודגימות מגוונות מאוד מחרקים ועד בני אדם. כיום קיים פער בתחום זה בנוגע לסטנדרטיזציה של LC, TIMS, Top, MS/MS בחקירות ליפידומיות.כאן אנו מספקים שיטה למעקב אחר ?...

Video: Author Spotlight: כימות דגימות ליפידומיות מורכבות באמצעות תיוג איזוטופים יציבים

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable isotope labeling (SIL) offers several advantages for the study of lipid distribution, mobilization, and metabolism, as well as de novo lipid synthesis. The successful implementation of the SIL technique requires the removal of interferences from endogenous molecules. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of SIL lipids from biological samples; examples will be shown of lipid de novo identification during mosquito ovary development. The use of complementary liquid chromatography trapped ion mobility spectrometry and mass spectrometry allows for the separation and lipids assignment from a single sample in a single scan (&lt;1 h). The described approach takes advantage of recent developments in data-dependent acquisition and data-independent acquisition, using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. The measurement of SIL at the fatty acid chain level reveals changes in lipid dynamics during the ovary development of mosquitoes. The lipids de novo structures are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

Presented here is a method for screening lipid structures through stable isotope labeling by using their retention time, mobility, and fragmentation.

Calibration of the Mass Spectrometer for Screening Lipids with Stable Isotope Labeling by LC-TIMS-TOF MS/MS

To begin the mass spectrometer, or MS calibration for LC-TIMS-TOF-MS/MS, open the TIMS control software, and under the calibration sub-tab, click on m/z, select tuning mix from the Dropbox, and click calibrate at the bottom right corner. Continue to click calibrate until a score of 100%is achieved. Now select the mobility tab, and follow the same steps as demonstrated until the 100%calibration score is reached.To generate each calibration point in the calibration curve, spike the lipid internal standard mixture with 10 microliters of deuterated internal standard mixture. Prepare seven such spiked samples for seven calibration points in the desired range. Using the data analysis software, manually annotate the fatty acid chains based on the passive MS/MS patterns.To determine the stable isotope labeling, or SIL efficiency, calculate the ratio of the area of the SIL-containing isotopes to the area of the non-SIL-containing isotopes. Calculate the theoretical pattern by determining the probability of finding a labeled atom at any site. Calculate SIL enrichment by fitting the experimental isotope profiles with the theoretical pattern simulated on data analysis software.To start the run, activate the column oven by clicking the thermometer button, and activate the pumps by clicking the valve button. Set the MS method to the appropriate method saved earlier. Verify that the injection volume is five microliters, and line one target's vial 20 to one, and save the sample list.Start the sequence, and confirm successful injection by the message stating injected, displayed on the system. Copy line one, and paste it below to generate a new line two. Populate line two with samples depending on the experiment.Ensure that the correct position in the autosampler is used. If the mobile phases are fresh, first perform a peak shape test with the lipid mixture standards from the manufacturer, to compare it with previous results. The lipid mixture and the standards are displayed on the screen.Make sure new lines have the correct separation method, and not the preconditioning method used in line one. Ensure that MS method entered is correct. Check that the correct processing method is loaded, and the run automated process is enabled.Save the sample list to ensure samples are analyzed after the current run finishes.

כיול ספקטרומטר המסות לסינון ליפידים עם תיוג איזוטופ יציב על ידי LC-TIMS-TOF MS/MS

LC-TIMS-TOF MS/MS Data Analysis for Screening Lipids with Stable Isotope Labeling

To begin, open the data analysis software. At the top left corner, click on the file button and select open. To select the files of choice, right click on the file name and select properties.Then select calibration status. At the dropdown box, select internal calibration for the mass spectrometer. Ensure that all errors are less than one parts per million.After that, select internal mobility calibration and confirm that the error is less than one part per million. Next, right click on chromatogram and select edit chromatogram. At type, click the dropdown box and select extracted ion chromatogram.Under filter, select all MS, and for scan mode, select all to view the peaks for the molecule of interest rather than only its fragments. There are two filter options for molecule selection, masses or formula. If masses is selected, choose the theoretical M over Z of the molecule of interest, which in this case is 829.7985.If formula is selected, choose the formula for the molecule and the ion forms of interest, which in this case is ammonium. For width, select plus or minus one. For polarity, ensure that it maintains the positive mode.Under mobility, select 1.455 to 1.465 to isolate the molecule of interest and filter out molecules not falling within these values. Once the parameters are selected, click change followed by okay at the top right. After a brief time, the software will process the selections and output a chromatogram.Right click at the baseline of the origin of the peak of interest and drag while holding to the end of the peak to obtain a live mass spectrum of fragments within that retention time. Right click at the left of the screen on mobilogram and select edit mobilogram. A window named edit mobilogram traces will appear.Follow the steps demonstrated previously. For retention time, input the retention time of the peak of interest. Once the parameters are selected, click add, and okay at the top right.Wait till the software processes the selections and outputs a chromatogram. For extracting ions, repeat the steps demonstrated previously until a list of ions is formed. At the bottom of the MS window, select profile MS and fragment MS to allow a spectrum view of ions from a full scan and passive.For the spectrum view, right click and select copy compound spectra. The spectrum data that appears at the right can provide more information on the compound, such as resolution resolving power, intensity, and signal-to-noise ratio. To process the data, manually integrate the chromatogram and mobility peaks to yield valuable information on the molecule of interest.Right click find and select compounds manually chromatogram or mobilogram. Left click and highlight the desired peak. The obtained information includes retention time, area, signal-to-noise ratio, and mobility.