作者感谢 Cesar Ramirez 博士在初始方法开发过程中的贡献。这项研究由捷克共和国捷克科学基金会向明尼苏达州提供的 NIAID 赠款 22-21244S 项目 R21AI167849 资助。

1. 样品制备
<ol><li>昆虫解剖<ol><li>使用微针解剖 埃及伊蚊 卵巢，当它们 7 天大时，在磷酸盐缓冲盐水溶液中。</li>
		<li>使用微针从磷酸盐缓冲盐水溶液中收集八个卵巢，并储存在 -80 °C 的 1.5 mL 微量离心管中。</li>
		<li>在生物重复中收集卵巢。</li>
	</ol></li>
	<li>脂质提取<ol><li>将 10 μL 内标 （ISTD） 加入收集的 8 个卵巢中，浓度为 1 ppm。ISTD 是一种标记的脂质混合物，含有 7 个 1-十五烷酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱-D7 的氘（15： 0-18：1 （D7） PC）、溶血磷脂酰胆碱-D7 （18：1 （D7） Lyso PC）、1-十五烷酰-2-十八碳烯酰-甘油-3-磷酸乙醇胺-D7 （15：0-18：1 （D7） PE）、1-油酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-D7 （18：1 （D7） Lyso PE）、1-十五烷酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇-D7 （15：0-18：1 （D7） PI）、1-十五烷酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸-D7 （15：0-18：1 （D7） PS）、1,2-二十五碳酰基-3-十八碳烯酰-sn-甘油（15：0-18：1-15：0 （D7） TAG）、1-十五碳酰-2-十八碳烯酰基）-sn-甘油-D7 （15：0-18：1 （D7） DAG）、2-十八碳烯酰-sn-甘油-D7 （18：1 MAG （D7））、胆固醇油酸酯-D7 （18：1 （D7） 胆固醇酯）。</li>
		<li>等到室温干燥。加入 100 μL 丁醇/甲醇和 3 μL 丁基化羟基甲苯。用 1.5 mL 聚丙烯研杵手动均质 10 秒。</li>
		<li>用 200 μL 丁醇/甲醇冲洗研杵，并与均质溶液混合。</li>
		<li>在室温和中等功率下对微量离心管进行超声处理 30 分钟。</li>
		<li>在 20 °C 下以 1600 x g 离心管 10 分钟。 将上清液转移至装有 300 μL 硅烷化玻璃内插管的自动进样器样品瓶中。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 仪器设置
<ol><li>制备流动相<ol><li>使用乙腈、水和异丙醇作为相应比例制备成分为 30：40：30（流动相 A）和 10：5：85（流动相 B）的流动相。在两种流动相中，加入 10 mmol/L 甲酸铵的水溶液和 0.1% 甲酸，以形成缓冲条件。</li>
		<li>称取 3.15 g 甲酸铵溶于 10 mL 水中。在 12.5 mL 水中加入 500 μL 此溶液。依次放入 250 mL 容量瓶中，用异丙醇填充至培养瓶的约 2/3 处。旋转混合。</li>
		<li>加入 250 μL 甲酸 （85%），加入 25 mL 乙腈和异丙醇至 250 mL 填充线，然后混合。</li>
	</ol></li>
	<li>在 MS 系统中，在屏幕左侧的 MS 设置中，通过选择 50 作为最小值，选择 1850 作为最大扫描设置来确定质量范围。<ol><li>选择 Polarity （极性） 作为正离子模式。选择扫描模式作为 DIA-PASEF。为此，请选择 Tune and open analysis method from a previous DDA method （ 优化 并使用以下 LC 参数从以前的 DDA 方法中打开分析方法）。<ol><li>对于梯度分离： 样品进样：0% B，保持时间 1 min。 增加至 55% B，保持至 6.4 分钟。 增加至 65% B，保持至 24 分钟。 增加至 88% B，保持至 40.8 分钟。 增加至 95% B，保持至 48.1 分钟。 维生素 B 降至 35%，保持至 56 分钟。 B降至 0%，保持至 60 分钟。</li>
			<li>对于 HPLC 条件： 进样体积：5 μL 溶剂速率：0.25 mL/min 总运行时间：60 min，其中 5 min 用于预处理色谱柱。</li>
			<li>通过将色谱柱插入液相色谱仪来制备液相色谱仪。运行空白以清洁色谱柱并测试是否有渗漏。这可以从仪器不保持压力或流量中看出。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>要创建新方法，请执行以下步骤 （图 1 和 图 2).<ol><li>打开软件并单击 Connect all instruments（连接所有仪器）。如果连接成功，液相色谱系统将发出一声蜂鸣声，控制屏幕在“状态”框中列出 HyStar，没有任何错误消息。</li>
		<li>单击 Acquisition 选项卡。在 Sample Table Navigator 中，找到 tag 下拉菜单并选择以前的方法。</li>
		<li>将最新样品表加倍。单击 Save As...（另存为... ）并保存新样品列表，格式为：YYYYMMDD_LIP_C30_（XXXX），其中 （XXXX） 是分析的简短描述符。</li>
		<li>右键单击分色方法，然后单击 Edit Method （编辑方法）。单击 Edit Module Method。</li>
		<li>点击 Download。如果成功，将弹出 Download succeeded。关闭屏幕而不保存方法。</li>
		<li>在 MS 设置下，转到 TIMS 设置，选择 1/k0 从 0.70 开始，1/k0 结束于 1.85。将斜坡时间设置为 150 毫秒。这样，占空比和斜坡速率就会自动调整。</li>
		<li>在底部窗口中，选择 Source 选项卡。选择源类型作为 ESI ，并将端板偏移设置为 800 V，将毛细管设置为 4500 V。检查雾化器盒并将压力设置为 4.0 bar。将干燥气体设置为 4.0 L/min，将干燥温度设置为 250 °C。</li>
		<li>在 source 选项卡的右侧，选择 Tune 选项卡。单击 General Sub 选项卡，然后在传输标题下确保以下参数： 偏转 1 delta：70 V 漏斗 1 RF：250 vpp isCID 能量：0 eV 漏斗 2 RF：250 vpp 多极射频：500 vpp。<ol><li>在 collision cell （碰撞单元） 标题下，确保以下参数： 碰撞能量：6.0 eV 碰撞 RF：1200 vpp。</li>
			<li>在四极杆标题下，确保以下参数： 离子能量：6 eV 低质量：250 m/z。</li>
			<li>在 focus pre-TOF 选项卡下，确保以下参数： 传输时间：45 μs 预脉冲存储：5.0 μs。</li>
		</ol></li>
		<li>单击 Processing Sub 选项卡。在质谱峰检测下，请确保以下参数： 绝对阈值：667 绝对阈值（每 100 毫秒 AccuTime）：445。<ol><li>在迁移率峰值检测下，请确保以下参数： 绝对阈值：30.00。</li>
		</ol></li>
		<li>单击 TIMS 子选项卡。在 offsets 选项卡下，确保以下参数： Δt1：-20 伏 Δt2： -150 伏 Δt3：70 伏 Δt4：150 伏 Δt5：0 伏 Δt6：150 伏 碰撞池：300 V。</li>
		<li>在 tune 选项卡的右侧，单击 MS/MS 选项卡。在母离子选项卡下，确保以下参数： PASEF 坡道数量：8 最低收费：1 最大充电量：1.<ol><li>在 Schedule 选项卡下，单击 Advanced 并确保以下参数： 强度：0,1500、5000、10000 重复：1、10、5、1 强度阈值：1500。</li>
			<li>在 active exclusion （活动排除） 选项卡下，确保以下参数： 主动排除复选标记 释放时间：0.4 分钟</li>
			<li>在 collision energy settings （碰撞能量设置） 下，确保以下参数： K0 （V-s/cm3）：0.70、1.60 碰撞能量 （eV）：20.00， 35.00。</li>
			<li>在隔离宽度设置下，确保以下参数： 质量（米/z）：622， 1222 宽度 （m/z）：1.00 2.50。</li>
		</ol></li>
		<li>DIA -PASEF 设置：从左侧的 MS 设置扫描模式中选择 DIA-PASEF 。在 MS/MS 选项卡下，选择 Window Editor。在这里，确保以下参数（图 3）： 窗口设置： 质量宽度：50 Da;质量重叠：0.0 Da;Calculate from polygon： mass steps;移动窗口数：1。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 校准
<ol><li>仪器校准（图 4）<ol><li>在 Calibration 子选项卡下，单击 m/z，从下拉框中选择 Tuning Mix ，然后单击右下角的 Calibrate 。</li>
		<li>继续单击 Calibrate（校准）， 直到达到 100% 的分数。</li>
		<li>现在选择 Mobility 选项卡并按照与上述相同的步骤操作，直到达到 100% 校准分数。</li>
	</ol></li>
	<li>校准曲线<ol><li>加标脂质体内标混合物，含 10 μL 氘代内标混合物。 使用 0.1-500 ng/mL 标准混合物和 10 μL 氘代内标混合物的 7 个校准点。</li>
		<li>根据2 中已经描述的 PASEF MS/MS 模式手动注释脂肪酸链。</li>
	</ol></li>
	<li>SIL 贴标效率<ol><li>计算含 SIL 同位素的面积与不含 SIL 的同位素的面积之比。</li>
		<li>通过确定在任何位点找到标记原子的概率来计算理论模式。</li>
		<li>通过将实验同位素谱与数据分析软件上模拟的理论模式拟合来计算 SIL 富集。</li>
	</ol></li>
	<li>开始运行<ol><li>单击 Thermometer 按钮激活柱温箱。通过单击 Valve 按钮激活泵。</li>
		<li>将 MS method （MS 方法） 设置为之前保存的方法。确认进样体积为 5 μL，并且第 1 行以 20：1 样品瓶为目标。</li>
		<li>确保样品瓶 20：1 的 IPA/ACN 含量为 50%。保存样品列表。</li>
		<li>启动序列并验证是否成功注射（由系统上显示的消息确认已注入）。</li>
		<li>复制第 1 行并粘贴在下面以生成新行。根据当前实验，用样品填充第 2 行。确保在自动进样器中使用正确的位置。</li>
		<li>如果流动相是新鲜的，则首先通过注入制造商提供的脂质混合物标准品进行峰形测试。与之前的结果进行比较。2 标准品是 1-十五烷酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（15：0-18：1 PC）、溶血磷脂酰胆碱（18：1 溶血酰 PC）、1-十五烷酰-2-十八碳烯酰-甘油-3-磷酸乙醇胺（15：0-18：1 PE）、1-油酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（18：1 Lyso PE）、1-十五烷酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇（15：0-18：1 PI）、1-十五烷酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（15：0-18：1 PS）、1,2-二十五碳酰基-3-十八碳烯酰-sn-甘油（15：0-18：1-15：0 TAG）、1-十五碳酰基-2-十八碳烯酰基）-sn-甘油（15：0-18：1 DAG）、2-十八碳烯酰-sn-甘油（18：1 MAG）、胆固醇油酸酯（18：1 胆固醇酯）。</li>
		<li>确保新行具有正确的分离方法，而不是行 1 中使用的预处理方法。确保 MS 方法正确（当天的方法）。</li>
		<li>检查是否加载了正确的处理方法，以及是否启用了 Run Automated Process 。</li>
		<li>保存样品列表以确保在当前运行完成后分析样品。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 数据分析
<ol><li>打开 数据分析 软件（图 5）。在左上角，单击 文件 按钮并选择 打开...</li>
	<li>选择所需的文件。右键单击文件名并选择 Properties （属性）。<ol><li>选择 Calibration Status （图 6）。在下拉框中，为质谱仪选择 Initial Calibration （初始校准 ）。确保所有误差均小于 1 ppm。</li>
		<li>接下来，选择 Initial Mobility Calibration 并确认误差小于 1 ppm。</li>
		<li>右键单击 Chromatogram（色谱图 ），然后选择 Edit Chromatogram（编辑色谱图 ）（图 6C）。在 “类型”中，单击下拉框并选择 “提取离子色谱图 ”（图 6D）。在过滤器下，选择 所有 MS ，在扫描模式下选择 全部。这是为了查看目标分子的峰，而不仅仅是其片段。<ol><li>在此之下，有两个用于分子选择的过滤器选项：Masses 或 Formula。如果选择了 质量 ，则可以选择感兴趣分子的理论 m/z。对于这种情况，请选择 829.7985 m/z。如果选择了 Formula（公式 ），则可以选择分子的公式以及色谱图的目标离子形式。在这种情况下，选择铵 [M+NH4]。这是因为流动相中的铵缓冲液有利于这种离子形式的电离（图 7）。</li>
			<li>对于 width （宽度），选择 ±1。对于极性，请确保它保持正模式。在 Mobility （移动度） 下，选择 1.455-1.465。 这样做是为了过滤掉任何不在这些值范围内的分子并分离出目标分子。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>选择参数后，单击右上角的 Add > OK 。片刻之后，软件将处理选择并输出色谱图。</li>
	<li>右键单击目标峰起点处的基线，然后按住峰的末尾进行拖动。这种手动积分将提供该保留时间内片段的实时质谱图。</li>
	<li>动能图<ol><li>右键单击 Mobilogram 的屏幕左侧，然后选择 Edit Mobilogram （图 8）。将出现一个名为 Edit Mobilogram Traces 的窗口。遵循相同的步骤 C.e.i.1 到 C.e.i.5（图 9）。</li>
		<li>在 Retention Time （保留时间 ） 处，输入目标峰的保留时间。在本例中为 37.45-37.55 分钟。</li>
		<li>选择参数后，单击右上角的 Add > OK 。片刻之后，软件将处理选择并输出色谱图。</li>
	</ol></li>
	<li>对于提取的离子，重复步骤 4.2.3.1-4.3.2.2，直到形成离子列表。</li>
	<li>在 MS 窗口底部，选择 Profile MS （分析 MS ） 和 Fragment MS（片段 MS）。这将允许获得来自全扫描和 PASEF 的离子的光谱视图。<ol><li>在谱图视图中，右键单击并选择 Copy Compound Spectra（复制化合物谱图）。通过右侧显示的光谱数据，您可以找到有关化合物的更多信息，例如分辨率、强度和信噪比（S/N; 图 10）。</li>
	</ol></li>
	<li>加工<ol><li>要处理数据，请手动积分色谱图和淌度峰，以产生有关目标分子的宝贵信息（图 10）。</li>
		<li>右键单击 Find（查找 ），然后选择 Integrate Only chromatogram （仅整合色谱图） 或 mobilogram（移动图）（图 11）。左键单击并突出显示所需的峰。此信息包括保留时间、面积、信噪比和迁移率。</li>
	</ol></li>
</ol>

使用稳定同位素标记筛选脂质结构

<ol>
	<li>Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotopically+labeled+internal+standards+in+quantitative+bioanalysis+using+liquid+chromatography/mass+spectrometry:+Necessity+or+not.">Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).</li><li>Tose, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+stable+isotope+labeling+and+liquid+chromatography-trapped+ion+mobility+spectrometry-time-of-flight-tandem+mass+spectrometry+for+de+novo+mosquito+ovarian+lipid+studies.">Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies.</a> Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).</li><li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics.">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).</li><li>Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+enhances+low-abundance+species+detection+in+untargeted+lipidomics.">Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics.</a> Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+parallel+accumulation-serial+fragmentation+(PASEF)+with+a+novel+trapped+ion+mobility+mass+spectrometer.">Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li><li>Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometric+approaches:+DIA,+WiSIM-DIA,+and+untargeted+DIA.">Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA.</a> Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+identification+strategy+on+the+reproducibility+of+the+DDA+and+DIA+results.">Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results.</a> J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).</li><li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+data+acquisition+and+processing+strategies+with+increased+throughput+and+selectivity:+PSMART+analysis+for+global+qualitative+and+quantitative+analysis.">Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).</li><li>Tsou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIA-umpire:+Comprehensive+computational+framework+for+data-independent+acquisition+proteomics.">DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics.</a> Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).</li><li>Triebl, A., Wenk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+considerations+of+stable+isotope+labelling+in+lipidomics.">Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics.</a> Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).</li></ol>

Matthew Willetts 和 Melvin A. Park 是 timsTOF 商用仪器制造商 Bruker Daltonics Inc 的员工。作者声明没有竞争性的经济利益。

在评估该方案的使用情况时，必须确保 DIA-PASEF 和 MS/MS 参数适用于所讨论的甘油三酯。具体来说，活动窗口和窗口宽度应遵循甘油三酯的模式。这可以通过使用 DDA 方法的上一次运行来确定。在追踪内标中的甘油三酯时，DIA 设置的窗口应覆盖所有预先确定的目标分子。窗口的大小应相等，范围在所需化合物的 m/z 和 1/k0 范围内（图 7）。如果窗口大小不正确，将跳过要碎裂的...

在分析脂质数据时，稳定同位素标记 （SIL） 是评估生物体代谢途径的有效方法。在这种方法中，分析物中的原子被含有 13C 或 2H 的稳定同位素取代。这些同位素进一步掺入前体中，这些前体随后嵌入脂肪酸中，标记它们所在的区域。使用这些同位素，人们能够识别脂质的分布和代谢，因为它们会与未标记的背景形成对比1。常见的质谱平台无法区分来自内源性分子的信号2。SIL 的成功需要使用超高分辨率的分析工具。液相色谱与高分辨率捕获离子淌度质谱-平行累积顺序碎裂-飞行时间串联质谱 （LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS） 联用，可分离标记和未标记物质2。LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS 分析的优势在于，可以通过保留时间 （RT） 和淌度过滤 MS 信号，从而减少内源性分子的潜在干扰，以及所有所需物质的定量和分离2。在 TIMS 中，离子首先在气体流动相上保持静止，然后根据其迁移率释放。这提供了高分辨率的移动图，同时在比早期 IMS 仪器更低的电压下运行3.移动量图是质量电荷与漂移时间的关系图，可用于根据化合物的漂移时间和重叠量来区分化合物4。
通过使用额外的 PASEF 技术，在不牺牲灵敏度的情况下大大提高了测序速度5。PASEF 理论涉及离子的积累，然后按照其迁移率的顺序顺序顺序释放。这是通过积累离子与其淌度平行来实现的。以这种方式积累可以防止离子损失。此外，母离子选择与离子的积累和释放同时发生。使用这种方法，PASEF 在每次 TIMS 扫描期间选择多个串联的母离子，而不是不使用 PASEF 的 TIMS 仪器通常每次扫描选择单个母离子。当母离子在每帧约 100 ms 的 TIMS 扫描中以 2 ms 的峰值同时积累和释放时，信号被放大超过一个数量级，因此信噪比增加3。在 TIMS 中增加 PASEF 可提高 MS/MS 的效率。由于 TIMS-PASEF 与 MS/MS 联用，因此可以实现更高效的碎裂。与传统的 MS/MS 检测不同，母离子信号从 TIMS-PASEF 压缩，碎片离子与母离子3 的 TIMS 洗脱时间和离子淌度位置同时检测。
从质谱仪采集数据时，扫描模式中有一些选项。数据依赖性采集 （DDA） 根据母离子的丰度从 MS1 扫描中选择母离子，然后将其碎裂并执行 MS2 扫描。此扫描模式会碎裂尽可能多的 precursors。DDA 方法是有针对性的，结果将取决于离子选择3。然而，DDA-PASEF 在重复之间的重现性方面经常存在问题。虽然 DDA 是重点分析的出色工具，但复杂混合物的数据采集难度更大6。这是因为只能同时监测少量离子3。数据非依赖型采集 （DIA） 是一种方法，其中 m/z 的预选窗口独立于其强度进行碎裂，并且所有窗口都在7 范围内进行扫描。使用这种扫描模式，整个离子云从 IMS 传输到质谱仪3。在蛋白质组学研究中，与 DDA 相比，这导致在更短的时间内定量了更多的蛋白质。此外，与 DDA 相比，DIA 遗漏的 m/z 值更少。因此，这种替代方案在信噪比的数据重现性和比 DDA 更好的定量方面显示出很大的改进。在这项工作中，我们的目标是将 DIA 实施到 Tose 等人 2 报告的方法。我们提高了信号的可重复性和强度，利用 DDA 和 DIA 采集获得了有关生物样品中 SIL 脂质动员、分布和代谢的进一步和更确凿的信息。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accucore C30 colum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27826-252130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Compass Data Analysis</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>2363525870</td>
			<td>Version 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose-13C6</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EquiSplash Lipidomix</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330731-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-417-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heavy water (2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>1.13366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene pestles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BAF199230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>L20234651907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silanized glass inserts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-251-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose-13C12</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>605417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>timsTOF</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>1.84443E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuning Mix Calibration Standard</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>36</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing de novo lipids using stable isotope labeling lc-tims-tof ms/ms

脂质高度多样化，脂质结构和组成的微小变化会对关键的生物学功能产生深远的影响。稳定同位素标记 （SIL） 为研究脂质分布、动员和代谢以及 从头 脂质合成提供了多种优势。SIL 技术的成功实施需要去除内源性分子的干扰。在本工作中，我们描述了一种用于从生物样品中筛选 SIL 脂质的高通量分析方案;将显示蚊子卵巢发育过程中脂质 从头 鉴定的示例。使用互补液相色谱捕获离子淌度光谱和质谱允许在单次扫描 （<1 h） 中从单个样品中分离和分配脂质。所描述的方法利用了数据依赖性采集和数据非依赖性采集的最新发展，在迁移陷阱中使用平行积累，然后是连续碎裂和碰撞诱导解离。脂肪酸链水平的 SIL 测量揭示了蚊子卵巢发育过程中脂质动力学的变化。脂质 从头 结构根据其保留时间、迁移率和碎裂模式进行可靠分配。

When analyzing lipid data, stable isotope labeling (SIL) is an effective method to assess metabolic pathways in living organisms. In this method, atoms within an analyte are replaced by stable isotopes containing 13C or 2H. These isotopes are further incorporated into precursors, which are later embedded within the fatty acids, labeling the areas in which they reside. With these isotopes, one is able to identify the distribution and metabolism of lipids, as they will contrast against the unlabeled background1. Common mass spectrometry platforms are not able to distinguish the signal coming from endogenous molecules2. The success of SIL requires the use of ultrahigh-resolution analytical tools. Liquid chromatography coupled to high-resolution trapped ion mobility spectrometry-parallel accumulation sequential fragmentation-time-of-flight tandem mass spectrometry (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) allows the separation of labeled and nonlabelled species2. The advantage of LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analysis is that the MS signal can be filtered by the retention time (RT) and mobility, thus reducing potential interferences of endogenous molecules, as well as quantification and separation of all desired species2. In TIMS, an ion is first held stationary against a gas-mobile phase and subsequently released according to its mobility. This provides high-resolution mobilograms while operating at a lower voltage than earlier IMS instrumentation3. Mobilograms are plots of mass to charge versus drift time that can be used to distinguish between compounds based off of their drift time and amount of overlap4.
By using an additional PASEF technique, sequencing speed is greatly increased without sacrificing sensitivity5. The PASEF theory involves the accumulation of ions followed by their sequential release in the order of their mobility. This is done by accumulating ions in parallel alignment to their mobility. The accumulation in this fashion prevents ion loss. Furthermore, the precursor ion selection occurs simultaneously with the accumulation and release of the ions. With this method, PASEF selects multiple precursors in series during each TIMS scan, rather than the individual precursors per scan typical of a TIMS instrument that does not use PASEF. When the precursor ions are concurrently accumulated and released in 2 ms peaks within a TIMS scan of approximately 100 ms per frame, the signal is amplified by over one order of magnitude, therefore increasing the signal-to-noise ratio3. The PASEF addition to the TIMS increases the efficiency of the MS/MS. As the TIMS-PASEF is coupled with MS/MS, a more efficient fragmentation is possible. Unlike conventional MS/MS detection, the precursor signal is compressed from the TIMS-PASEF, and the fragment ions are detected simultaneously to the TIMS elution time and ion mobility position of the precursor3.
When acquiring data from a mass spectrometer, there are options in the scan mode desired. Data dependent acquisition (DDA) selects precursor ions from the MS1 scan based on their abundances, before fragmenting them and performing the MS2 scan. This scan mode fragments as many precursors as possible. The DDA approach is targeted, and results will depend on the ion selection3. However, DDA-PASEF often has problems in the reproducibility between replicates. While DDA is a great tool in a focused analysis, complex mixtures have greater difficulty in their data acquisition6. This is because only a small amount of ions can be monitored simultaneously3. Data independent acquisition (DIA) is a method where preselected windows of m/z are fragmented independently from their intensity, and all are scanned within the range7. With this scan mode, entire ion clouds are transmitted from the IMS to the mass spectrometer3. In proteomics studies this results in greater amounts of proteins being quantified in a shorter time span compared to DDA. In addition, DIA misses fewer m/z values compared to DDA. Therefore, this alternative has shown great improvements in data reproducibility in signal to noise ratio and better quantification than DDA. In this present work, our goal is to implement DIA to the method reported by Tose et al.2. We improved the reproducibility and intensity of signals, yielding further and more conclusive information on SIL lipids mobilization, distribution and metabolism in biological samples taking advantage of DDA and DIA acquisition.

作者聚焦：使用稳定同位素标记定量复杂脂质组学样品

使用稳定同位素标记 LC-TIMS-TOF MS/MS 从 头 追踪脂质

This research intends to implement more specific quantification in lipidomic samples using stable isotope labeling. This allows us to understand lipid panels and highly diverse samples from insects to humans. There currently is a gap in this field regarding the standardization of LC, TIMS, Top, MS/MS in lipidomic investigations.Here we provide a method for tracking biomass remains for this purpose. In the future, our research will involve the investigation of epigenetics and metabolomics present in the biological process using the LC team staff, MS/MS, involve DDA and DIA methods.

稳定同位素标记有助于在雌性蚊子卵巢的脂质动力学研究中实现甘油三酯的可视化。在 2D 淌度域中，甘油三酯 48：1 显示在与淌度 1/K0 相关的特定保留时间的区域。甘油三酯的强度可以通过较深的蓝色线来显示。其他斑点代表在卵巢中发现的其他甘油三酯。由于质量和结构的差异，保留时间和迁移率也不同，因此出现在图表的不同区域。在区分样品中的甘油三酯时，这些差异是关键（<stro...

这里介绍的是一种利用其保留时间、迁移率和碎裂通过稳定同位素标记来筛选脂质结构的方法。

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

本研究旨在使用稳定同位素标记在脂质组学样品中实现更特异性的定量。这使我们能够了解脂质面板和从昆虫到人类的高度多样化的样品。目前，该领域在脂质组学研究中 LC、TIMS、Top、MS/MS 的标准化方面存在差距。在这里，我们提供了一种为此目的跟踪生物量遗骸的方法。未来，我们的研究将涉及使用 LC 团队工作人员 MS/MS 对生物过程中存在的表观遗传学和代谢组学进行调查，涉及 DDA 和 DIA 方法。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

697 次观看.  Florida International University. 本研究旨在使用稳定同位素标记在脂质组学样品中实现更特异性的定量。这使我们能够了解脂质面板和从昆虫到人类的高度多样化的样品。目前，该领域在脂质组学研究中 LC、TIMS、Top、MS/MS 的标准化方面存在差距。在这里，我们提供了一种为此目的跟踪生物量遗骸的方法。未来，我们的研究将涉及使用 LC 团队工作人员 MS/MS 对生物过程中存在的表观遗传学和代谢组学进?...