Les auteurs tiennent à souligner la contribution du Dr Cesar Ramirez au cours du développement initial de la méthode. Cette recherche a été financée par les subventions du NIAID R21AI167849 au FGN, le projet 22-21244S de la Fondation tchèque pour la science, République tchèque au MN.

1. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Dissection d’insectes<ol><li>Disséquez les ovaires du moustique Aedes aegypti à l’âge de 7 jours dans une solution saline tamponnée au phosphate à l’aide de micro-aiguilles.</li>
		<li>Prélever huit ovaires dans une solution saline tamponnée au phosphate à l’aide de micro-aiguilles et les stocker dans des tubes à microcentrifuger de 1,5 mL à -80 °C.</li>
		<li>Prélever les ovaires en répliques biologiques.</li>
	</ol></li>
	<li>Extraction des lipides<ol><li>Ajouter 10 μL d’étalon interne (ISTD) dans les huit ovaires prélevés à une concentration de 1 ppm. L’ISTD est un mélange lipidique marqué avec sept deutériums de 1-pentadécanoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine-D7 (15:0-18:1 (D7) PC), lysophosphatidylcholine-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadécanoyl-2-octadécénoyl-glycéro-3-phosphoéthanolamine-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oléoyl-2-hydroxy-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadécanoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadécanoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-sérine-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadécanoyl-3-octadécénoyl-sn-glycérol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadécanoyl-2-octadécénoyl)-sn-glycérol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-octadéconoyl-sn-glycérol-D7 (18:1 MAG (D7)), oléate de cholestéryle-D7 (18:1 (D7) ester de chol).</li>
		<li>Attendre qu’il soit sec à température ambiante. Ajouter 100 μL de butanol/méthanol et 3 μL d’hydroxytoluène butylé. Homogénéiser manuellement pendant 10 s avec des pilons en polypropylène de 1,5 ml.</li>
		<li>Rincez le pilon avec 200 μL de butanol/méthanol et combinez-le avec la solution homogénéisée.</li>
		<li>Sonicer le tube de microcentrifugation à température ambiante et à puissance moyenne pendant 30 min.</li>
		<li>Tubes de centrifugation à 1600 x g pendant 10 min à 20 °C. Transvaser le surnageant dans un flacon d’échantillonneur automatique contenant 300 μL d’inserts en verre silanisé.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Configuration de l’instrument
<ol><li>Préparation de la phase mobile<ol><li>Préparez la phase mobile avec une composition de 30:40:30 (phase mobile A) et 10:5:85 (phase mobile B) en utilisant de l’acétonitrile, de l’eau et de l’isopropanol dans la proportion respective. Dans les deux phases mobiles, ajouter 10 mmol/L de formiate d’ammonium dans de l’eau et 0,1 % d’acide formique pour créer une condition tampon.</li>
		<li>Peser 3,15 g de formiate d’ammonium dans 10 mL d’eau. Ajouter 500 μL de cette solution dans 12,5 mL d’eau. Dans l’ordre, mettre dans une fiole jaugée de 250 mL et remplir d’isopropanol jusqu’à environ 2/3 de la fiole. Mélanger en remuant.</li>
		<li>Ajouter 250 μL d’acide formique (85 %), remplir avec 25 mL d’acétonitrile et d’isopropanol jusqu’à la ligne de remplissage de 250 mL et mélanger.</li>
	</ol></li>
	<li>Dans le système MS, sur le côté gauche de l’écran, dans les paramètres MS, déterminez la plage de masse en sélectionnant 50 comme réglage de balayage minimum et 1850 comme paramètre de balayage maximum.<ol><li>Sélectionnez Polarité comme mode d’ions positifs. Sélectionnez le mode de balayage DIA-PASEF. Pour ce faire, sélectionnez Régler et ouvrez la méthode d’analyse d’une méthode DDA précédente avec les paramètres LC suivants.<ol><li>Pour la séparation de gradient : Injection de l’échantillon : 0 % B, temps de maintien 1 min. Augmenter à 55 % de B, maintenir jusqu’à 6,4 min. Augmenter à 65 % de B, maintenir jusqu’à 24 min. Augmenter à 88 % de B, maintenir jusqu’à 40,8 min. Augmenter à 95 % de B, maintenir jusqu’à 48,1 min. Réduire à 35 % de B, maintenir jusqu’à 56 min. Réduire à 0% B, maintenir jusqu’à 60 min.</li>
			<li>Pour les conditions HPLC : Volume d’injection : 5 μL Taux de solvant : 0,25 mL/min Durée totale de fonctionnement : 60 min, dont 5 min pour préconditionner la colonne.</li>
			<li>Préparez le chromatographe liquide en insérant la colonne dans le chromatographe liquide. Exécutez une pièce blanche pour nettoyer la colonne et tester les fuites. Cela se voit dans le fait que l’instrument ne maintient pas la pression ou le débit.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Pour créer une méthode, effectuez les étapes décrites ci-dessous (Graphique 1 et Graphique 2).<ol><li>Ouvrez le logiciel et cliquez sur Connecter tous les instruments. Si la connexion réussit, le système LC émettra un bip et l’écran de contrôle répertorie HyStar dans la case d’état sans aucun message d’erreur.</li>
		<li>Cliquez sur l’onglet Acquisition . Dans le navigateur de tables d’échantillons, recherchez le menu déroulant des balises et sélectionnez une méthode précédente.</li>
		<li>Doubler le dernier tableau d’échantillons. Cliquez sur Enregistrer sous... et enregistrez une nouvelle liste d’exemples au format : YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) où (XXXX) est un descripteur court de l’analyse.</li>
		<li>Faites un clic droit sur la méthode de séparation et cliquez sur Modifier la méthode. Cliquez sur Modifier la méthode du module.</li>
		<li>Cliquez sur Télécharger. En cas de succès, le téléchargement réussi apparaîtra. Fermer l’écran sans méthode d’enregistrement.</li>
		<li>Sous Paramètres MS, allez dans les paramètres TIMS, sélectionnez le 1/k0 à partir de 0,70 et 1/k0 à 1,85. Réglez le temps de rampe sur 150 ms. Ainsi, le cycle de service et le taux de rampe sont automatiquement ajustés.</li>
		<li>Dans la fenêtre inférieure, sélectionnez l’onglet Source . Sélectionnez le type de source ESI et réglez le décalage de la plaque d’extrémité sur 800 V et le capillaire sur 4500 V. Vérifiez le boîtier du nébuliseur et réglez la pression sur 4,0 bars. Réglez le gaz sec à 4,0 L/min et la température sèche à 250 °C.</li>
		<li>À droite de l’onglet source, sélectionnez l’onglet Tune. Cliquez sur le sous-onglet Général et, sous l’en-tête de transfert, assurez-vous que les paramètres suivants sont définis : Déviation 1 delta : 70 V Entonnoir 1 RF : 250 vpp Énergie isCID : 0 eV Entonnoir 2 RF : 250 vpp RF multipolaire : 500 vpp.<ol><li>Sous l’en-tête de la cellule de collision, assurez-vous des paramètres suivants : Énergie de collision : 6,0 eV Collision RF : 1200 vpp.</li>
			<li>Sous l’en-tête quadripolaire, assurez-vous des paramètres suivants : Énergie ionique : 6 eV Faible masse : 250 m/z.</li>
			<li>Sous l’onglet focus pré-TOF, assurez-vous des paramètres suivants : Temps de transfert : 45 μs Stockage pré-impulsionnel : 5,0 μs.</li>
		</ol></li>
		<li>Cliquez sur le sous-onglet Traitement . La détection des pics sous spectres de masse garantit les paramètres suivants : Seuil absolu : 667 Seuil absolu (par 100 ms AccuTime) : 445.<ol><li>Sous la détection des pics de mobilité, assurez-vous des paramètres suivants : Seuil absolu : 30,00.</li>
		</ol></li>
		<li>Cliquez sur le sous-onglet TIMS . Sous l’onglet Décalages, assurez-vous des paramètres suivants : Δt1 : -20 V Δt2 : -150 V Δt3 : 70 V Δt4 : 150 V Δt5 : 0 V Δt6 : 150 V Cellule de collision : 300 V.</li>
		<li>À droite de l’onglet tune, cliquez sur l’onglet MS/MS . Sous l’onglet ions précurseurs, assurez-vous des paramètres suivants : Nombre de rampes PASEF : 8 Charge minimale : 1 Charge maximale :1.<ol><li>Sous l’onglet Planification, cliquez sur Avancé et assurez-vous des paramètres suivants : Intensités : 0,1500, 5000, 10000 Répétition : 1, 10, 5, 1 Seuil d’intensité : 1500.</li>
			<li>Sous l’onglet d’exclusion actif, assurez-vous d’utiliser les paramètres suivants : Coche d’exclusion active Relâchement après : 0,4 min.</li>
			<li>Sous les paramètres d’énergie de collision, assurez-vous des paramètres suivants : K0 (V-s/cm3) : 0,70, 1,60 Énergie de collision (eV) : 20.00, 35.00.</li>
			<li>Sous les paramètres de largeur d’isolement, assurez-vous que les paramètres suivants sont les suivants : Masse (m/z) : 622, 1222 Largeur (m/z) : 1.00 2.50.</li>
		</ol></li>
		<li>Configuration DIA -PASEF : Sélectionnez DIA-PASEF dans le mode de balayage des paramètres MS sur la gauche. Sous l’onglet MS/MS, sélectionnez Éditeur de fenêtres. Ici, assurez-vous des paramètres suivants (Figure 3) : Paramètres de la fenêtre : Largeur de masse : 50 Da ; Chevauchement de masse : 0,0 Da ; Calculer à partir du polygone : pas de masse ; Nombre de fenêtres de mobilité : 1.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Calibrage
<ol><li>Étalonnage de l’instrument (Figure 4)<ol><li>Sous le sous-onglet Calibrage , cliquez sur m/z, sélectionnez Tuning Mix dans la liste déroulante et cliquez sur Calibrer dans le coin inférieur droit.</li>
		<li>Continuez à cliquer sur Calibrer jusqu’à ce qu’un score de 100 % soit atteint.</li>
		<li>Sélectionnez maintenant l’onglet Mobilité et suivez les mêmes étapes que ci-dessus jusqu’à ce que le score d’étalonnage de 100 % soit atteint.</li>
	</ol></li>
	<li>Courbe d’étalonnage<ol><li>Mélange d’étalon interne de lipides de pointe avec 10 μL de mélange d’étalon interne deutéré. Utilisez sept points d’étalonnage de 0,1 à 500 ng/mL de mélange étalon avec 10 μL de mélange d’étalon interne deutéré.</li>
		<li>Annoter manuellement les chaînes d’acides gras sur la base des modèles PASEF MS/MS déjà décrits en2.</li>
	</ol></li>
	<li>Efficacité de l’étiquetage SIL<ol><li>Calculer le rapport entre l’aire des isotopes contenant des SIL et l’aire des isotopes ne contenant pas de SIL.</li>
		<li>Calculez le modèle théorique en déterminant la probabilité de trouver un atome marqué n’importe quel site.</li>
		<li>Calculez l’enrichissement SIL en ajustant les profils isotopiques expérimentaux avec le modèle théorique simulé sur un logiciel d’analyse de données.</li>
	</ol></li>
	<li>Démarrage de la course<ol><li>Activez le four à colonne en cliquant sur le bouton Thermomètre . Activez les pompes en cliquant sur le bouton Valve .</li>
		<li>Définissez la méthode MS sur la méthode enregistrée précédemment. Vérifiez que le volume d’injection est de 5 μL et que la ligne 1 ciblera le flacon 20:1.</li>
		<li>Assurez-vous que le flacon 20:1 contient 50 % d’alcool isopropylique/ACN. Enregistrez la liste d’échantillons.</li>
		<li>Démarrez la séquence et vérifiez qu’une injection a réussi (confirmée par un message affiché sur le système indiquant injecté).</li>
		<li>Copiez la ligne 1 et collez-la ci-dessous pour générer une nouvelle ligne. Remplissez la ligne 2 avec des échantillons en fonction de l’expérience en cours. Assurez-vous que la position correcte dans l’échantillonneur automatique est utilisée.</li>
		<li>Si la phase mobile est fraîche, effectuez d’abord un test de forme maximale en injectant les étalons de mélange de lipides du fabricant. Comparez avec les résultats précédents. 2 Il s’agit d’un mélange lipidique composé de 1-pentadécanoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (15:0-18:1 PC), de lysophosphatidylcholine (18:1 Lyso PC), de 1-pentadécanoyl-2-octadécénoyl-glycéro-3-phosphoéthanolamine (15:0-18:1 PE), de 1-oléoyl-2-hydroxy-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (18:1 Lyso PE), de 1-pentadécanoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoinositol (15:0-18:1 PI), de 1-pentadécanoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-sérine (15:0-18:1 PS), de 1,2- dipentadécanoyl-3-octadécénoyl-sn-glycérol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadécanoyl-2-octadécénoyl)-sn-glycérol (15:0-18:1 DAG), 2-octadécénoyl-sn-glycérol (18:1 MAG), oléate de cholestéryle (18:1 ester de chol).</li>
		<li>Assurez-vous que les nouvelles lignes ont la bonne méthode de séparation et non la méthode de préconditionnement utilisée dans la ligne 1. Assurez-vous que la méthode MS est correcte (méthode du jour).</li>
		<li>Vérifiez que la méthode de traitement correcte est chargée et que l’option Exécuter le processus automatisé est activée.</li>
		<li>Enregistrez la liste d’échantillons pour vous assurer que les échantillons sont analysés une fois l’exécution en cours terminée.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analyse des données
<ol><li>Logiciel d’analyse de données ouvertes (Figure 5). Dans le coin supérieur gauche, cliquez sur le bouton Fichier et sélectionnez Ouvrir...</li>
	<li>Sélectionnez les fichiers de votre choix. Faites un clic droit sur le nom du fichier et sélectionnez Propriétés.<ol><li>Sélectionnez État de l’étalonnage (Figure 6). Dans la liste déroulante, sélectionnez Étalonnage initial pour le spectromètre de masse. Assurez-vous que toutes les erreurs sont inférieures à 1 ppm.</li>
		<li>Ensuite, sélectionnez Étalonnage initial de la mobilité et vérifiez que l’erreur est inférieure à 1 ppm.</li>
		<li>Faites un clic droit sur Chromatogramme et sélectionnez Modifier le chromatogramme (Figure 6C). Dans Type, cliquez sur la liste déroulante et sélectionnez Chromatogramme ionique extrait (Figure 6D). Sous Filtre, sélectionnez Tous les MS et, en mode de balayage, sélectionnez Tous. Il s’agit de voir les pics de la molécule d’intérêt plutôt que seulement ses fragments.<ol><li>En dessous, il existe deux options de filtre pour la sélection des molécules : Masses ou Formule. Si Masses est sélectionné, on peut choisir le m/z théorique des molécules d’intérêt. Pour ce cas, sélectionnez 829,7985 m/z. Si l’option Formule est sélectionnée, on peut choisir la formule de la molécule ainsi que les formes ioniques d’intérêt pour le chromatogramme. Dans ce cas, sélectionnez l’ammonium [M+NH4]. Cela est dû au tampon d’ammonium en phase mobile qui va favoriser l’ionisation sous cette forme ionique (Figure 7).</li>
			<li>Pour la largeur, sélectionnez ±1. Pour la polarité, assurez-vous qu’il maintient le mode positif. Sous Mobilité , sélectionnez 1,455-1,465. Ceci est fait pour filtrer toutes les molécules qui ne correspondent pas à ces valeurs et isoler la molécule d’intérêt.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Une fois les paramètres sélectionnés, cliquez sur Ajouter > OK en haut à droite. Après un court laps de temps, le logiciel traitera les sélections et produira un chromatogramme.</li>
	<li>Faites un clic droit sur la ligne de base au début du pic d’intérêt et faites-le glisser tout en maintenant jusqu’à la fin du pic. Cette intégration manuelle fournira un spectre de masse en direct de fragments dans ce temps de rétention.</li>
	<li>Mobilogramme<ol><li>Cliquez avec le bouton droit de la souris à gauche de l’écran sur Mobilogram et sélectionnez Modifier le Mobilogramme (Figure 8). Une fenêtre nommée Modifier les traces du Mobilogramme apparaîtra. Suivez les mêmes étapes C.e.i.1 à C.e.i.5 (Figure 9).</li>
		<li>Dans Temps de rétention , entrez le temps de rétention du pic d’intérêt. Dans ce cas, 37,45-37,55 min.</li>
		<li>Une fois les paramètres sélectionnés, cliquez sur Ajouter > OK en haut à droite. Après un court laps de temps, le logiciel traitera les sélections et produira un chromatogramme.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour les ions extraits, répétez les étapes 4.2.3.1 à 4.3.2.2 jusqu’à ce qu’une liste d’ions se forme.</li>
	<li>En bas de la fenêtre MS, sélectionnez Profile MS et Fragment MS. Cela permettra d’obtenir une vue spectrale des ions à partir d’un balayage complet et d’un PASEF.<ol><li>Dans la vue du spectre, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Copier les spectres composés. Avec les données spectrales qui apparaissent à droite, on peut trouver plus d’informations sur son composé telles que la résolution, le pouvoir de résolution, l’intensité et le rapport signal/bruit (S/N ; Figure 10).</li>
	</ol></li>
	<li>Traitement<ol><li>Pour traiter les données, intégrez manuellement le chromatogramme et les pics de mobilité afin d’obtenir des informations précieuses sur la molécule d’intérêt (Figure 10).</li>
		<li>Cliquez avec le bouton droit de la souris sur Rechercher et sélectionnez Intégrer uniquement le chromatogramme ou le mobilogramme (Figure 11). Faites un clic gauche et mettez en surbrillance le pic souhaité. Ces informations comprennent le temps de rétention, la zone, le numéro de série et la mobilité.</li>
	</ol></li>
</ol>

Criblage des structures lipidiques à l’aide du marquage des isotopes stables

<ol>
	<li>Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotopically+labeled+internal+standards+in+quantitative+bioanalysis+using+liquid+chromatography/mass+spectrometry:+Necessity+or+not.">Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).</li><li>Tose, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+stable+isotope+labeling+and+liquid+chromatography-trapped+ion+mobility+spectrometry-time-of-flight-tandem+mass+spectrometry+for+de+novo+mosquito+ovarian+lipid+studies.">Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies.</a> Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).</li><li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics.">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).</li><li>Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+enhances+low-abundance+species+detection+in+untargeted+lipidomics.">Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics.</a> Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+parallel+accumulation-serial+fragmentation+(PASEF)+with+a+novel+trapped+ion+mobility+mass+spectrometer.">Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li><li>Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometric+approaches:+DIA,+WiSIM-DIA,+and+untargeted+DIA.">Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA.</a> Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+identification+strategy+on+the+reproducibility+of+the+DDA+and+DIA+results.">Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results.</a> J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).</li><li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+data+acquisition+and+processing+strategies+with+increased+throughput+and+selectivity:+PSMART+analysis+for+global+qualitative+and+quantitative+analysis.">Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).</li><li>Tsou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIA-umpire:+Comprehensive+computational+framework+for+data-independent+acquisition+proteomics.">DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics.</a> Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).</li><li>Triebl, A., Wenk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+considerations+of+stable+isotope+labelling+in+lipidomics.">Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics.</a> Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).</li></ol>

Matthew Willetts et Melvin A. Park sont des employés de Bruker Daltonics Inc., le fabricant de l’instrument commercial timsTOF. Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Lors de l’évaluation de l’utilisation de ce protocole, il est essentiel de s’assurer que les paramètres DIA-PASEF et MS/MS sont applicables aux triglycérides en question. Plus précisément, les fenêtres de mobilité et la largeur de la fenêtre doivent suivre le modèle des triglycérides. Cela peut être déterminé à l’aide d’une exécution précédente à l’aide de la méthode DDA. Lors du suivi des triglycérides dans l’étalon interne, les fenêtres de mise en place de l’DIA doivent couvrir tou...

Lors de l’analyse des données lipidiques, le marquage des isotopes stables (SIL) est une méthode efficace pour évaluer les voies métaboliques dans les organismes vivants. Dans cette méthode, les atomes d’un analyte sont remplacés par des isotopes stables contenant 13C ou 2H. Ces isotopes sont ensuite incorporés dans des précurseurs, qui sont ensuite intégrés dans les acides gras, marquant les zones dans lesquelles ils résident. Avec ces isotopes, on est en mesure d’identifier la distribution et le métabolisme des lipides, car ils contrastent avec le fond non marqué1. Les plateformes courantes de spectrométrie de masse ne sont pas capables de distinguer le signal provenant des molécules endogènes2. Le succès de SIL passe par l’utilisation d’outils analytiques à ultra-haute résolution. La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de mobilité des ions piégés à haute résolution-accumulation parallèle, fragmentation séquentielle-temps de vol, spectrométrie de masse en tandem (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) permet de séparer les espèces marquées et non marquées2. L’avantage de l’analyse LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS est que le signal MS peut être filtré par le temps de rétention (RT) et la mobilité, réduisant ainsi les interférences potentielles des molécules endogènes, ainsi que la quantification et la séparation de toutes les espèces souhaitées2. Dans TIMS, un ion est d’abord maintenu stationnaire contre une phase gazo-mobile, puis libéré en fonction de sa mobilité. Cela permet d’obtenir des mobilogrammes haute résolution tout en fonctionnant à une tension inférieure à celle de l’instrumentation IMS3 précédente. Les mobilogrammes sont des graphiques de la masse à charge en fonction du temps de dérive qui peuvent être utilisés pour distinguer les composés en fonction de leur temps de dérive et de la quantité de chevauchement4.
En utilisant une technique PASEF supplémentaire, la vitesse de séquençage est considérablement augmentée sans sacrifier la sensibilité5. La théorie PASEF implique l’accumulation d’ions suivie de leur libération séquentielle dans l’ordre de leur mobilité. Cela se fait en accumulant des ions dans un alignement parallèle à leur mobilité. L’accumulation de cette manière empêche la perte d’ions. De plus, la sélection des ions précurseurs se produit en même temps que l’accumulation et la libération des ions. Avec cette méthode, PASEF sélectionne plusieurs précurseurs en série lors de chaque balayage TIMS, plutôt que les précurseurs individuels par balayage typiques d’un instrument TIMS qui n’utilise pas PASEF. Lorsque les ions précurseurs sont accumulés et libérés simultanément en pics de 2 ms dans le cadre d’un balayage TIMS d’environ 100 ms par trame, le signal est amplifié de plus d’un ordre de grandeur, ce qui augmente le rapport signal/bruit3. L’ajout du PASEF au TIMS augmente l’efficacité du MS/MS. Comme le TIMS-PASEF est couplé à MS/MS, une fragmentation plus efficace est possible. Contrairement à la détection MS/MS conventionnelle, le signal du précurseur est compressé à partir du TIMS-PASEF, et les ions fragmentaires sont détectés simultanément au temps d’élution TIMS et à la position de mobilité ionique du précurseur3.
Lors de l’acquisition de données à partir d’un spectromètre de masse, il existe des options dans le mode de balayage souhaité. L’acquisition dépendante des données (DDA) sélectionne les ions précurseurs du balayage MS1 en fonction de leur abondance, avant de les fragmenter et d’effectuer le balayage MS2. Ce mode d’analyse fragmente autant de précurseurs que possible. L’approche DDA est ciblée et les résultats dépendront de la sélection de l’ion3. Cependant, le DDA-PASEF présente souvent des problèmes de reproductibilité entre les répétitions. Bien que la DDA soit un excellent outil dans une analyse ciblée, les mélanges complexes ont plus de difficultés dans l’acquisition de leurs données6. En effet, seule une petite quantité d’ions peut être surveillée simultanément3. L’acquisition indépendante des données (DIA) est une méthode dans laquelle les fenêtres présélectionnées de m/z sont fragmentées indépendamment de leur intensité, et toutes sont balayées dans la plage7. Avec ce mode de balayage, des nuages d’ions entiers sont transmis de l’IMS au spectromètrede masse 3. Dans les études protéomiques, cela se traduit par de plus grandes quantités de protéines quantifiées dans un laps de temps plus court par rapport à la DDA. De plus, DIA manque moins de valeurs m/z par rapport à DDA. Par conséquent, cette alternative a montré de grandes améliorations dans la reproductibilité des données dans le rapport signal sur bruit et une meilleure quantification que la DDA. Dans ce travail, notre objectif est d’appliquer la DIA à la méthode rapportée par Tose et al.2. Nous avons amélioré la reproductibilité et l’intensité des signaux, ce qui nous a permis d’obtenir des informations supplémentaires et plus concluantes sur la mobilisation, la distribution et le métabolisme des lipides SIL dans les échantillons biologiques, en tirant parti de l’acquisition de DDA et de DIA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accucore C30 colum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27826-252130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Compass Data Analysis</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>2363525870</td>
			<td>Version 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose-13C6</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EquiSplash Lipidomix</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330731-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-417-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heavy water (2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>1.13366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene pestles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BAF199230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>L20234651907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silanized glass inserts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-251-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose-13C12</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>605417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>timsTOF</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>1.84443E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuning Mix Calibration Standard</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>36</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing de novo lipids using stable isotope labeling lc-tims-tof ms/ms

Les lipides sont très diversifiés, et de petits changements dans les structures et la composition des lipides peuvent avoir des effets profonds sur les fonctions biologiques critiques. Le marquage des isotopes stables (SIL) offre plusieurs avantages pour l’étude de la distribution, de la mobilisation et du métabolisme des lipides, ainsi que pour la synthèse de novo des lipides. La mise en œuvre réussie de la technique SIL nécessite l’élimination des interférences des molécules endogènes. Dans le présent travail, nous décrivons un protocole analytique à haut débit pour le criblage des lipides SIL à partir d’échantillons biologiques ; Des exemples d’identification lipidique de novo au cours du développement des ovaires des moustiques seront présentés. L’utilisation de la chromatographie en phase liquide complémentaire, de la spectrométrie de mobilité des ions piégés et de la spectrométrie de masse permet la séparation et l’attribution des lipides à partir d’un seul échantillon en un seul balayage (<1 h). L’approche décrite tire parti des développements récents en matière d’acquisition dépendante des données et d’acquisition indépendante des données, en utilisant l’accumulation parallèle dans le piège de mobilité suivie d’une fragmentation séquentielle et d’une dissociation induite par la collision. La mesure de la SIL au niveau de la chaîne d’acides gras révèle des changements dans la dynamique des lipides au cours du développement ovaire des moustiques. Les structures lipidiques de novo sont attribuées avec confiance en fonction de leur temps de rétention, de leur mobilité et de leur modèle de fragmentation.

When analyzing lipid data, stable isotope labeling (SIL) is an effective method to assess metabolic pathways in living organisms. In this method, atoms within an analyte are replaced by stable isotopes containing 13C or 2H. These isotopes are further incorporated into precursors, which are later embedded within the fatty acids, labeling the areas in which they reside. With these isotopes, one is able to identify the distribution and metabolism of lipids, as they will contrast against the unlabeled background1. Common mass spectrometry platforms are not able to distinguish the signal coming from endogenous molecules2. The success of SIL requires the use of ultrahigh-resolution analytical tools. Liquid chromatography coupled to high-resolution trapped ion mobility spectrometry-parallel accumulation sequential fragmentation-time-of-flight tandem mass spectrometry (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) allows the separation of labeled and nonlabelled species2. The advantage of LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analysis is that the MS signal can be filtered by the retention time (RT) and mobility, thus reducing potential interferences of endogenous molecules, as well as quantification and separation of all desired species2. In TIMS, an ion is first held stationary against a gas-mobile phase and subsequently released according to its mobility. This provides high-resolution mobilograms while operating at a lower voltage than earlier IMS instrumentation3. Mobilograms are plots of mass to charge versus drift time that can be used to distinguish between compounds based off of their drift time and amount of overlap4.
By using an additional PASEF technique, sequencing speed is greatly increased without sacrificing sensitivity5. The PASEF theory involves the accumulation of ions followed by their sequential release in the order of their mobility. This is done by accumulating ions in parallel alignment to their mobility. The accumulation in this fashion prevents ion loss. Furthermore, the precursor ion selection occurs simultaneously with the accumulation and release of the ions. With this method, PASEF selects multiple precursors in series during each TIMS scan, rather than the individual precursors per scan typical of a TIMS instrument that does not use PASEF. When the precursor ions are concurrently accumulated and released in 2 ms peaks within a TIMS scan of approximately 100 ms per frame, the signal is amplified by over one order of magnitude, therefore increasing the signal-to-noise ratio3. The PASEF addition to the TIMS increases the efficiency of the MS/MS. As the TIMS-PASEF is coupled with MS/MS, a more efficient fragmentation is possible. Unlike conventional MS/MS detection, the precursor signal is compressed from the TIMS-PASEF, and the fragment ions are detected simultaneously to the TIMS elution time and ion mobility position of the precursor3.
When acquiring data from a mass spectrometer, there are options in the scan mode desired. Data dependent acquisition (DDA) selects precursor ions from the MS1 scan based on their abundances, before fragmenting them and performing the MS2 scan. This scan mode fragments as many precursors as possible. The DDA approach is targeted, and results will depend on the ion selection3. However, DDA-PASEF often has problems in the reproducibility between replicates. While DDA is a great tool in a focused analysis, complex mixtures have greater difficulty in their data acquisition6. This is because only a small amount of ions can be monitored simultaneously3. Data independent acquisition (DIA) is a method where preselected windows of m/z are fragmented independently from their intensity, and all are scanned within the range7. With this scan mode, entire ion clouds are transmitted from the IMS to the mass spectrometer3. In proteomics studies this results in greater amounts of proteins being quantified in a shorter time span compared to DDA. In addition, DIA misses fewer m/z values compared to DDA. Therefore, this alternative has shown great improvements in data reproducibility in signal to noise ratio and better quantification than DDA. In this present work, our goal is to implement DIA to the method reported by Tose et al.2. We improved the reproducibility and intensity of signals, yielding further and more conclusive information on SIL lipids mobilization, distribution and metabolism in biological samples taking advantage of DDA and DIA acquisition.

Pleins feux sur l’auteur : Quantification d’échantillons lipidomiques complexes à l’aide du marquage d’isotopes stables

Traçage de novo des lipides à l’aide du marquage des isotopes stables LC-TIMS-TOF MS/MS

This research intends to implement more specific quantification in lipidomic samples using stable isotope labeling. This allows us to understand lipid panels and highly diverse samples from insects to humans. There currently is a gap in this field regarding the standardization of LC, TIMS, Top, MS/MS in lipidomic investigations.Here we provide a method for tracking biomass remains for this purpose. In the future, our research will involve the investigation of epigenetics and metabolomics present in the biological process using the LC team staff, MS/MS, involve DDA and DIA methods.

Le marquage des isotopes stables facilite la visualisation des triglycérides dans les études de dynamique lipidique des ovaires de moustiques femelles. Dans le domaine de la mobilité 2D, le triglycéride 48:1 est affiché dans une région avec un temps de rétention spécifique par rapport à la mobilité 1/K0. L’intensité du triglycéride peut être visualisée par une ligne bleue plus foncée. D’autres taches représentent des triglycérides supplémentaires trouvés dans l’ovaire. Les temps de ré...

Voici une méthode de criblage des structures lipidiques par marquage d’isotopes stables en utilisant leur temps de rétention, leur mobilité et leur fragmentation.

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

Cette recherche vise à mettre en œuvre une quantification plus spécifique dans des échantillons lipidomiques en utilisant le marquage d’isotopes stables. Cela nous permet de comprendre des panels lipidiques et des échantillons très divers, des insectes aux humains. Il existe actuellement une lacune dans ce domaine en ce qui concerne la normalisation de la LC, du TIMS, du Top, de la MS/MS dans les investigations lipidomiques.Nous proposons ici une méthode de suivi des restes de biomasse à cet effet. À l’avenir, nos recherches impliqueront l’étude de l’épigénétique et de la métabolomique présentes dans le processus biologique en utilisant le personnel de l’équipe LC, MS/MS, en utilisant les méthodes DDA et DIA.

tracing-de-novo-lipids-using-stable-isotope-labeling-lc-tims-tof-msms

Research

JoVE Journal

Chemistry

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

698 vues.  Florida International University. Cette recherche vise à mettre en œuvre une quantification plus spécifique dans des échantillons lipidomiques en utilisant le marquage d’isotopes stables. Cela nous permet de comprendre des panels lipidiques et des échantillons très divers, des insectes aux humains. Il existe actuellement une lacune dans ce domaine en ce qui concerne la normalisation de la LC, du TIMS, du Top, de la MS/MS dans les investigations lipidomiques.Nous proposons ici une méthode de suivi des restes de...