著者らは、初期のメソッド開発における Cesar Ramirez 博士の貢献に感謝したいと思います。この研究は、NIAIDの助成金R21AI167849 FGNのプロジェクト22-21244S、チェコ科学財団、チェコ共和国からミネソタ州に資金提供されました。

1. サンプル調製
<ol><li>昆虫の解剖<ol><li>Aedes aegypti蚊の卵巣を生後7日で、マイクロニードルを使用してリン酸緩衝生理食塩水で解剖します。</li>
		<li>リン酸緩衝生理食塩水からマイクロニードルを使用して8つの卵巣を採取し、-80°Cで1.5 mLの微量遠心チューブに保存します。</li>
		<li>生物学的複製物で卵巣を採取します。</li>
	</ol></li>
	<li>脂質抽出<ol><li>10 μL の内部標準物質 (ISTD) を 1 ppm の濃度で採取した 8 つの卵巣に加えます。ISTDは、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン-D7(15:)の7つの重水素を含む標識脂質混合物です。 0-18:1(D7)PC)、リゾホスファチジルコリン-D7(18:1(D7)Lyso PC)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-D7(15:0-18:1(D7)PE)、1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-D7(18:1(D7)Lyso PE)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホイノシトール-D7(15:0-18:1(D7)PI)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン-D7(15:0-18:1 (D7) PS)、1,2-ジペンタデカノイル-3-オクタデセノイル-sn-グリセロール (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル)-sn-グリセロール-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG)、2-オクタデセノイル-sn-グリセロール-D7 (18:1 MAG (D7))、オレイン酸コレステリル-D7 (18:1 (D7) チョルエステル)。</li>
		<li>室温で乾くまで待ちます。100 μLのブタノール/メタノールと3 μLのブチル化ヒドロキシトルエンを加えます。1.5 mLのポリプロピレン製乳棒で10秒間、手作業で均質化します。</li>
		<li>乳棒を200μLのブタノール/メタノールですすぎ、均質化した溶液と混ぜ合わせます。</li>
		<li>マイクロ遠心チューブを室温および中出力で30分間超音波処理します。</li>
		<li>チューブを1600 x g で20°Cで10分間遠心分離します。 上清を300 μLのシラン化ガラスインサートでオートサンプラーバイアルに移します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 機器のセットアップ
<ol><li>移動相の準備<ol><li>アセトニトリル、水、イソプロパノールをそれぞれの割合として使用して、30:40:30(移動相 A)と 10:5:85(移動相 B)の組成で移動相を調製します。両方の移動相で、10 mmol/L ギ酸アンモニウムを水と 0.1% ギ酸に添加して緩衝条件を作成します。</li>
		<li>3.15 gのギ酸アンモニウムを10 mLの水で秤量します。この溶液500μLを12.5mLの水に加えます。順番に、250mLメスフラスコに入れ、フラスコの約2/3までイソプロパノールを充填します。渦を巻いて混ぜます。</li>
		<li>250 μL のギ酸 (85%) を加え、250 mL の充填ラインに 25 mL のアセトニトリルとイソプロパノールを充填し、混合します。</li>
	</ol></li>
	<li>MSシステムでは、画面の左側にあるMS設定で、最小スキャン設定として50を選択し、最大スキャン設定として1850を選択して、質量範囲を決定します。<ol><li>ポジティブイオンモードとして 極性 を選択します。スキャンモードを DIA-PASEFとして選択します。これを行うには、[ Tune and open analysis method from a previous DDA method with the following LC parameters]を選択します。<ol><li>グラジエント分離の場合: サンプル注入:0% B、保持時間1分 55%Bに増やし、6.4分まで保持します。 Bを65%に増やし、24分間保持します。 88%Bに増やし、40.8分まで保持します。 95%Bに増やし、48.1分まで保持します。 Bを35%に減らし、56分まで保持します。 0%Bに減らし、60分まで保持します。</li>
			<li>HPLC条件の場合: 注入量:5 μL 溶媒速度:0.25 mL/min 合計実行時間: 60 分で、そのうち 5 分はカラムの前処理を行います。</li>
			<li>液体クロマトグラフにカラムを挿入して、液体クロマトグラフを調製します。ダミーを使用してカラムをクリーニングし、漏れがないかテストします。これは、機器が圧力や流れを保持していないことに見られます。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>新しいメソッドを作成するには、以下で説明する手順を実行します (図 1 そして 図 2).<ol><li>ソフトウェアを開き、[ すべての機器を接続]をクリックします。接続が成功すると、LCシステムはビープ音を1回鳴らし、制御画面のStatusボックスにHyStarが表示され、エラーメッセージは表示されません。</li>
		<li>「Acquisition」タブをクリックします。サンプルテーブルナビゲータで、タグドロップダウンメニューを見つけ、前の方法を選択します。</li>
		<li>最新のサンプルテーブルを2倍にします。 「Save As... 」をクリックし、新しいサンプルリストを次の形式で保存します。YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) は分析の短い記述子です。</li>
		<li>分離方法を右クリックし、[ Edit Method]をクリックします。 「Edit Module Method」をクリックします。</li>
		<li>「ダウンロード」をクリックします。成功すると、[ダウンロードに成功しました]がポップアップ表示されます。保存せずに画面を閉じます。</li>
		<li>[MS 設定] で [TIMS 設定] に移動し、0.70 の 1/k0 開始と 1.85 の 1/k0 終了を選択します。ランプ時間を 150 ミリ秒に設定します。これにより、デューティサイクルとランプレートが自動的に調整されます。</li>
		<li>下部のウィンドウで、[ ソース ]タブを選択します。ソースタイプを ESI として選択し、エンドプレートオフセットを800Vに、キャピラリーを4500Vに設定します。乾燥ガスを4.0 L / minに、乾燥温度を250°Cに設定します。</li>
		<li>ソースタブの右側にある「Tune」タブを選択します。 「一般 サブ」タブをクリックし、転送見出しの下で次のパラメータを確認します。 たわみ1デルタ:70 V ファネル1 RF:250 vpp isCIDエネルギー:0 eV ファネル2 RF:250 vpp 多極RF:500 vpp。<ol><li>衝突セルの見出しの下で、次のパラメータを確認します。 衝突エネルギー:6.0 eV 衝突RF:1200 vpp。</li>
			<li>四重極の見出しの下で、次のパラメータを確認してください。 イオンエネルギー:6 eV 低質量:250 m/z。</li>
			<li>フォーカスが合っているPre-TOFタブで、次のパラメータを確認します。 転送時間:45μs プレパルス保存:5.0μs。</li>
		</ol></li>
		<li>「Processing Sub」タブをクリックします。質量スペクトルピーク検出では、以下のパラメータを確認してください。 絶対しきい値: 667 絶対しきい値 (100 ミリ秒 AccuTime あたり): 445。<ol><li>移動度ピーク検出では、次のパラメータを確認してください。 絶対しきい値: 30.00。</li>
		</ol></li>
		<li>「TIMS」サブタブをクリックします。「offsets」タブで、次のパラメータを確認します。 Δt1:-20V Δt2:-150V Δt3:70V Δt4:150V Δt5:0V Δt6:150V コリジョンセル:300 V。</li>
		<li>「tune」タブの右側にある「 MS/MS 」タブをクリックします。[プリカーサーイオン]タブで、次のパラメーターを確認します。 PASEFランプの数:8 最小充電:1 最大充電:1。<ol><li>「スケジューリング」タブで、「 詳細 」をクリックし、次のパラメータを確認します。 強度:0,1500、5000、10000 繰り返し:1、10、5、1 強度しきい値: 1500。</li>
			<li>「アクティブな除外」タブで、次のパラメータを確認します。 アクティブな除外チェック マーク リリース時間後:0.4分</li>
			<li>衝突エネルギー設定では、次のパラメータを確認してください。 K0(V-s / cm3):0.70、1.60 衝突エネルギー(eV):20.00、35.00。</li>
			<li>[独立性の幅] 設定で、次のパラメーターを確認します。 質量(m / z):622、1222 幅(m / z):1.00 2.50。</li>
		</ol></li>
		<li>DIA -PASEFのセットアップ:左側のMS設定スキャンモードから DIA-PASEF を選択します。[MS/MS] タブで、[ ウィンドウ エディタ] を選択します。ここでは、次のパラメータを確認します(図3)。 ウィンドウ設定:質量幅:50 Da;質量オーバーラップ:0.0 Da;ポリゴンから計算します:マスステップ。移動ウィンドウの数:1。</li>
	</ol></li>
</ol>3. キャリブレーション
<ol><li>機器のキャリブレーション(図4)<ol><li>[Calibration]サブタブで[m / z]をクリックし、ドロップボックスから[Tuning Mix]を選択して、右下隅にある[Calibrate]をクリックします。</li>
		<li>スコアが 100% に達するまで [調整] をクリックし続けます。</li>
		<li>次に、[ モビリティ ]タブを選択し、100%のキャリブレーションスコアに達するまで上記と同じ手順に従います。</li>
	</ol></li>
	<li>検量線<ol><li>10 μL の重水素化内部標準混合物を含む脂質内部標準混合物をスパイクします。 0.1〜500 ng/mLの標準混合物と10 μLの重水素化内部標準混合物から7つのキャリブレーションポイントを使用します。</li>
		<li>2で既に説明したPASEF MS/MSパターンに基づいて脂肪酸鎖に手動でアノテーションします。</li>
	</ol></li>
	<li>SILラベリング効率<ol><li>同位体を含むSILの面積と同位体を含まないSILの面積の比を計算します。</li>
		<li>任意のサイトで標識された原子を見つける確率を決定することにより、理論的なパターンを計算します。</li>
		<li>実験用同位体プロファイルをデータ解析ソフトウェアでシミュレーションされた理論パターンに適合させることにより、SIL濃縮を計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>実行の開始<ol><li>カラムオーブンをアクティブにするには、[ 温度計 ]ボタンをクリックします。 [バルブ ]ボタンをクリックしてポンプをアクティブにします。</li>
		<li>MS メソッドを、以前に保存したメソッドに設定します。注入量が 5 μL で、ライン 1 がバイアル 20:1 をターゲットとしていることを確認します。</li>
		<li>バイアル20:1に50%のIPA / ACNがあることを確認してください。サンプルリストを保存します。</li>
		<li>シーケンスを開始し、挿入が成功したことを確認します (挿入されたことを示すメッセージがシステムに表示されることで確認されます)。</li>
		<li>行 1 をコピーし、下に貼り付けて新しい行を生成します。2行目に、現在の実験に応じたサンプルを入力します。オートサンプラーの正しい位置が使用されていることを確認してください。</li>
		<li>移動相が新鮮な場合は、まずメーカーから提供された脂質混合物のスタンダードを注入してピーク形状試験を実施します。以前の結果と比較します。2 標準試料は、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(15:0-18:1 PC)、リゾホスファチジルコリン(18:1 Lyso PC)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(15:0-18:1 PE)、1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:1 Lyso PE)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホイノシトール(15:0-18:1 PI)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(15:0-18:1 PS)、1,2-ジペンタデカノイル-3-オクタデセノイル-sn-グリセロール(15:0-18:1-15:0 TAG)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル)-sn-グリセロール(15:0-18:1 DAG)、2-オクタデセノイル-sn-グリセロール(18:1 MAG)、オレイン酸コレステリル(18:1 Chol Ester)。</li>
		<li>新しいラインの分離方法が正しいこと、およびライン 1 で使用した前処理方法ではないことを確認します。MSメソッドが正しいことを確認します(当日のメソッド)。</li>
		<li>正しい処理方法がロードされていること、および 「自動化プロセスの実行 」が有効になっていることを確認します。</li>
		<li>サンプルリストを保存して、現在の実行の終了後にサンプルが分析されるようにします。</li>
	</ol></li>
</ol>4. データ分析
<ol><li>Open Data Analysis ソフトウェア(図5)。左上隅にある [ファイル ]ボタンをクリックし、[ 開く]を選択します...</li>
	<li>選択したファイルを選択します。ファイル名を右クリックして、[ プロパティ]を選択します。<ol><li>[Calibration Status]を選択します(図6)。ドロップダウンボックスで、質量分析計の[Initial Calibration]を選択します。すべてのエラーが 1 ppm 未満であることを確認してください。</li>
		<li>次に、[ Initial Mobility Calibration ]を選択し、エラーが1 ppm未満であることを確認します。</li>
		<li>[クロマトグラム]を右クリックし、[クロマトグラムの編集]を選択します(図 6C)。[Type]でドロップダウンボックスをクリックし、[Extracted Ion Chromatogram]を選択します(図 6D)。フィルターで「すべてのMS」を選択し、スキャンモードで「すべて」を選択します。これは、目的の分子のフラグメントだけでなく、そのピークを表示するためです。<ol><li>この下に、分子選択のための2つのフィルターオプションがあります:質量またはフォーミュラ。 「質量 」を選択すると、対象の分子の理論上のm/zを選択できます。この場合は、829.7985 m/z を選択します。 Formula を選択すると、分子のフォーミュラとクロマトグラムの対象となるイオン形態を選択できます。この場合、アンモニウム[M+NH4]を選択します。これは、移動相のアンモニウムバッファーがこのイオン形態でのイオン化を促進するためです(図7)。</li>
			<li>幅には ±1 を選択します。極性については、ポジティブモードを維持していることを確認してください。 [モビリティ ] で [1.455-1.465 ] を選択します。これは、これらの値に該当しない分子を除外し、目的の分子を分離するために行われます。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>パラメータを選択したら、右上の [追加]>[OK ]をクリックします。しばらくすると、ソフトウェアは選択を処理し、クロマトグラムを出力します。</li>
	<li>対象のピークの始点の基線で右クリックし、ピークの終点まで押したままドラッグします。この手動統合により、その保持時間内にフラグメントのライブ質量スペクトルが得られます。</li>
	<li>モビログラム<ol><li>Mobilogramの画面左側を右クリックし、[Edit Mobilogram]を選択します(図8)。Edit Mobilogram Traces という名前のウィンドウが表示されます。C.e.i.1からC.e.i.5まで、同じ手順に従います(図9)。</li>
		<li>At Retention Timeに、対象ピークの保持時間を入力します。この場合、37.45-37.55分。</li>
		<li>パラメータを選択したら、右上の [追加]>[OK ]をクリックします。しばらくすると、ソフトウェアは選択を処理し、クロマトグラムを出力します。</li>
	</ol></li>
	<li>抽出されたイオンについては、イオンのリストが形成されるまで手順4.2.3.1〜4.3.2.2を繰り返します。</li>
	<li>MS ウィンドウの下部で、[ Profile MS ] と [Fragment MS] を選択します。これにより、フルスキャンとPASEFからのイオンのスペクトル表示が可能になります。<ol><li>スペクトル表示で、右クリックして「 Copy Compound Spectra」を選択します。右側に表示されるスペクトルデータを使用すると、分解能分解能、強度、信号対雑音比(S/N; 図 10)。</li>
	</ol></li>
	<li>加工<ol><li>データを処理するには、クロマトグラムと移動度ピークを手動で波形解析して、目的の分子に関する貴重な情報を得ることができます(図 10)。</li>
		<li>[Find]を右クリックし、[Integrate Only chromatogram]または[Mobilogram]を選択します(図 11)。左クリックして、目的のピークをハイライトします。この情報には、保持時間、面積、S/N、移動性が含まれます。</li>
	</ol></li>
</ol>

安定同位体標識を用いた脂質構造のスクリーニング

<ol>
	<li>Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotopically+labeled+internal+standards+in+quantitative+bioanalysis+using+liquid+chromatography/mass+spectrometry:+Necessity+or+not.">Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).</li><li>Tose, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+stable+isotope+labeling+and+liquid+chromatography-trapped+ion+mobility+spectrometry-time-of-flight-tandem+mass+spectrometry+for+de+novo+mosquito+ovarian+lipid+studies.">Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies.</a> Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).</li><li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics.">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).</li><li>Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+enhances+low-abundance+species+detection+in+untargeted+lipidomics.">Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics.</a> Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+parallel+accumulation-serial+fragmentation+(PASEF)+with+a+novel+trapped+ion+mobility+mass+spectrometer.">Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li><li>Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometric+approaches:+DIA,+WiSIM-DIA,+and+untargeted+DIA.">Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA.</a> Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+identification+strategy+on+the+reproducibility+of+the+DDA+and+DIA+results.">Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results.</a> J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).</li><li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+data+acquisition+and+processing+strategies+with+increased+throughput+and+selectivity:+PSMART+analysis+for+global+qualitative+and+quantitative+analysis.">Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).</li><li>Tsou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIA-umpire:+Comprehensive+computational+framework+for+data-independent+acquisition+proteomics.">DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics.</a> Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).</li><li>Triebl, A., Wenk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+considerations+of+stable+isotope+labelling+in+lipidomics.">Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics.</a> Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).</li></ol>

Matthew WillettsとMelvin A. Parkは、timsTOF商用楽器のメーカーであるBruker Daltonics Inc.の従業員です。著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

このプロトコルの使用を評価する際には、DIA-PASEFおよびMS/MSパラメータが問題のトリグリセリドに適用可能であることを確認することが不可欠です。具体的には、モビリティウィンドウとウィンドウ幅はトリグリセリドのパターンに従う必要があります。これは、DDA メソッドを使用して前回の実行で決定できます。内部標準でトリグリセリドを追跡する場合、DIAセットアップのウィンドウは?...

脂質データを分析する場合、安定同位体標識(SIL)は、生体内の代謝経路を評価するための効果的な方法です。この方法では、分析種内の原子を 13Cまたは 2Hを含む安定同位体で置換します。これらの同位体はさらに前駆体に組み込まれ、後で脂肪酸に埋め込まれ、それらが存在する領域にラベルが付けられます。これらの同位体を使用すると、脂質の分布と代謝を特定することができます。脂質は、ラベルのない背景1と対照的です。一般的な質量分析プラットフォームでは、内因性分子からのシグナルを区別することができません2。SILを成功させるには、超高分解能分析ツールの使用が必要です。高分解能のトラップイオンモビリティー分光法-並列蓄積シーケンシャルフラグメンテーション飛行時間型タンデム質量分析(LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS)と組み合わせた液体クロマトグラフィーにより、標識分子種と非標識分子種の分離が可能になります2。LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS 分析の利点は、MS シグナルを保持時間(RT)と移動度でフィルタリングできるため、内因性分子の潜在的な干渉を減らすことができるだけでなく、必要なすべての分子種の定量と分離できることです2。TIMSでは、イオンは最初にガス移動相に対して静止したままになり、その後、その移動度に応じて放出されます。これにより、以前のIMS計装3よりも低い電圧で動作しながら、高解像度のモビログラムが得られます。モビログラムは、電荷する質量とドリフト時間のプロットであり、ドリフト時間とオーバーラップの量に基づいて化合物を区別するために使用できます4。
追加のPASEF技術を使用することで、感度5を犠牲にすることなく、シーケンシング速度が大幅に向上します。PASEF理論では、イオンが蓄積し、その後、移動度の順に順次放出されます。これは、イオンをその移動度に平行に整列させて蓄積することによって行われます。このように蓄積することで、イオンロスを防ぎます。さらに、プリカーサーイオンの選択は、イオンの蓄積と放出と同時に行われます。この方法では、PASEFは、PASEFを使用しないTIMS装置に典型的なスキャンごとの個々の前駆体ではなく、各TIMSスキャン中に複数の前駆体を直列に選択します。フレームあたり約100 msのTIMSスキャンで、プリカーサーイオンが2 msのピークで同時に蓄積および放出されると、シグナルは1桁以上増幅されるため、S/N比が増加します3。TIMSにPASEFを追加すると、MS/MSの効率が向上します。TIMS-PASEFはMS/MSと結合されているため、より効率的なフラグメンテーションが可能です。従来のMS/MS検出とは異なり、TIMS-PASEFからプリカーサーシグナルを圧縮し、プリカーサー3のTIMS溶出時間およびイオン移動度位置にフラグメントイオンを同時に検出します。
質量分析計からデータを取得する場合、必要なスキャンモードのオプションがあります。データ依存性取得(DDA)は、MS1スキャンから存在量に基づいてプリカーサーイオンを選択し、その後、プリカーサーイオンを断片化してMS2スキャンを実行します。このスキャンモードは、できるだけ多くの前駆体をフラグメント化します。DDAアプローチはターゲットを絞っており、結果はイオン選択によって異なります3。しかし、DDA-PASEFは、反復間の再現性に問題が生じることがよくあります。DDAは焦点を絞った分析に最適なツールですが、複雑な混合物はデータ取得がより困難になります6。これは、同時に監視できるイオンが少量しかないためです3。データ独立集録(DIA)は、事前に選択されたm/zのウィンドウを強度とは無関係に断片化し、すべてを範囲7内でスキャンする方法です。このスキャンモードでは、イオン雲全体がIMSから質量分析計3に送信されます。プロテオミクス研究では、DDAと比較して、より短い時間でより多くのタンパク質を定量することができます。さらに、DIAはDDAと比較してm/z値の欠落が少なくなっています。したがって、この代替案は、DDAよりもS/N比のデータの再現性が大幅に向上し、定量化が優れていることを示しています。この本研究では、Tose et al.2によって報告された方法にDIAを実装することを目標としています。シグナルの再現性と強度を向上させ、DDAおよびDIA取得を活用して、生体サンプル中のSIL脂質の動員、分布、代謝に関する決定的な情報をますます得ることができました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accucore C30 colum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27826-252130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Compass Data Analysis</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>2363525870</td>
			<td>Version 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose-13C6</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EquiSplash Lipidomix</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330731-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-417-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heavy water (2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>1.13366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene pestles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BAF199230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>L20234651907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silanized glass inserts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-251-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose-13C12</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>605417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>timsTOF</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>1.84443E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuning Mix Calibration Standard</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
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tracing de novo lipids using stable isotope labeling lc-tims-tof ms/ms

脂質は非常に多様であり、脂質の構造と組成のわずかな変化は、重要な生物学的機能に大きな影響を与える可能性があります。安定同位体標識(SIL)は、脂質の分布、動員、代謝、 およびde novo 脂質合成の研究にいくつかの利点を提供します。SIL技術を成功裏に実装するには、内因性分子からの干渉の除去が必要です。本研究では、生体サンプルからSIL脂質をスクリーニングするためのハイスループット分析プロトコルについて説明します。蚊の卵巣発育中の脂質 de novo 同定の例を示します。補完的な液体クロマトグラフィー、トラップドイオンモビリティー分析、および質量分析を使用すると、1回のスキャン(<1時間)で1つのサンプルから分離および脂質の割り当てが可能になります。ここで説明するアプローチは、データ依存型取得とデータ非依存型取得の最近の開発を利用しており、移動度トラップでの並列蓄積とそれに続く逐次フラグメンテーションと衝突による解離を使用します。脂肪酸鎖レベルでのSILの測定により、蚊の卵巣発育中の脂質動態の変化が明らかになります。脂質 de novo 構造は、その保持時間、移動度、およびフラグメンテーションパターンに基づいて自信を持って割り当てられます。

When analyzing lipid data, stable isotope labeling (SIL) is an effective method to assess metabolic pathways in living organisms. In this method, atoms within an analyte are replaced by stable isotopes containing 13C or 2H. These isotopes are further incorporated into precursors, which are later embedded within the fatty acids, labeling the areas in which they reside. With these isotopes, one is able to identify the distribution and metabolism of lipids, as they will contrast against the unlabeled background1. Common mass spectrometry platforms are not able to distinguish the signal coming from endogenous molecules2. The success of SIL requires the use of ultrahigh-resolution analytical tools. Liquid chromatography coupled to high-resolution trapped ion mobility spectrometry-parallel accumulation sequential fragmentation-time-of-flight tandem mass spectrometry (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) allows the separation of labeled and nonlabelled species2. The advantage of LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analysis is that the MS signal can be filtered by the retention time (RT) and mobility, thus reducing potential interferences of endogenous molecules, as well as quantification and separation of all desired species2. In TIMS, an ion is first held stationary against a gas-mobile phase and subsequently released according to its mobility. This provides high-resolution mobilograms while operating at a lower voltage than earlier IMS instrumentation3. Mobilograms are plots of mass to charge versus drift time that can be used to distinguish between compounds based off of their drift time and amount of overlap4.
By using an additional PASEF technique, sequencing speed is greatly increased without sacrificing sensitivity5. The PASEF theory involves the accumulation of ions followed by their sequential release in the order of their mobility. This is done by accumulating ions in parallel alignment to their mobility. The accumulation in this fashion prevents ion loss. Furthermore, the precursor ion selection occurs simultaneously with the accumulation and release of the ions. With this method, PASEF selects multiple precursors in series during each TIMS scan, rather than the individual precursors per scan typical of a TIMS instrument that does not use PASEF. When the precursor ions are concurrently accumulated and released in 2 ms peaks within a TIMS scan of approximately 100 ms per frame, the signal is amplified by over one order of magnitude, therefore increasing the signal-to-noise ratio3. The PASEF addition to the TIMS increases the efficiency of the MS/MS. As the TIMS-PASEF is coupled with MS/MS, a more efficient fragmentation is possible. Unlike conventional MS/MS detection, the precursor signal is compressed from the TIMS-PASEF, and the fragment ions are detected simultaneously to the TIMS elution time and ion mobility position of the precursor3.
When acquiring data from a mass spectrometer, there are options in the scan mode desired. Data dependent acquisition (DDA) selects precursor ions from the MS1 scan based on their abundances, before fragmenting them and performing the MS2 scan. This scan mode fragments as many precursors as possible. The DDA approach is targeted, and results will depend on the ion selection3. However, DDA-PASEF often has problems in the reproducibility between replicates. While DDA is a great tool in a focused analysis, complex mixtures have greater difficulty in their data acquisition6. This is because only a small amount of ions can be monitored simultaneously3. Data independent acquisition (DIA) is a method where preselected windows of m/z are fragmented independently from their intensity, and all are scanned within the range7. With this scan mode, entire ion clouds are transmitted from the IMS to the mass spectrometer3. In proteomics studies this results in greater amounts of proteins being quantified in a shorter time span compared to DDA. In addition, DIA misses fewer m/z values compared to DDA. Therefore, this alternative has shown great improvements in data reproducibility in signal to noise ratio and better quantification than DDA. In this present work, our goal is to implement DIA to the method reported by Tose et al.2. We improved the reproducibility and intensity of signals, yielding further and more conclusive information on SIL lipids mobilization, distribution and metabolism in biological samples taking advantage of DDA and DIA acquisition.

著者スポットライト:安定同位体標識を用いた複雑なリピドームサンプルの定量(英語)

安定同位体標識 LC-TIMS-TOF MS/MS を用いた de novo 脂質の追跡

安定同位体標識は、雌の蚊の卵巣の脂質動態研究におけるトリグリセリドの可視化を容易にします。2D移動度ドメインでは、トリグリセリド48:1は、移動度1 / K0に対して特定の保持時間を持つ領域に表示されます。トリグリセリドの強度は、濃い青色の線で視覚化できます。他の斑点は、卵巣内に見られる追加のトリグリセリドを表しています。保持時間と移動性は、質量と構造の違?...

ここでは、安定同位体標識により、その保持時間、移動度、およびフラグメンテーションを利用した脂質構造をスクリーニングする方法を紹介します。

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

この研究では、安定同位体標識を使用して、リピドミクスサンプルでより特異的な定量を実施することを目的としています。これにより、脂質パネルや昆虫からヒトまでの非常に多様なサンプルを理解することができます。現在、この分野では、リピドミクス研究におけるLC、TIMS、Top、MS/MSの標準化に関してギャップがあります。ここでは、この目的のためにバイオマス残骸を追跡する方法を提供します。将来的には、LCチームのスタッフを用いた生体プロセスにおけるエピジェネティクスやメタボロミクスの研究、MS/MS、DDA法、DIA法の研究を行う予定です。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

776 ビュー.  Florida International University. この研究では、安定同位体標識を使用して、リピドミクスサンプルでより特異的な定量を実施することを目的としています。これにより、脂質パネルや昆虫からヒトまでの非常に多様なサンプルを理解することができます。現在、この分野では、リピドミクス研究におけるLC、TIMS、Top、MS/MSの標準化に関してギャップがあります。ここでは、この目的のためにバイ?...

ビデオ: 著者スポットライト:安定同位体標識を用いた複雑なリピドームサンプルの定量(英語)

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable isotope labeling (SIL) offers several advantages for the study of lipid distribution, mobilization, and metabolism, as well as de novo lipid synthesis. The successful implementation of the SIL technique requires the removal of interferences from endogenous molecules. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of SIL lipids from biological samples; examples will be shown of lipid de novo identification during mosquito ovary development. The use of complementary liquid chromatography trapped ion mobility spectrometry and mass spectrometry allows for the separation and lipids assignment from a single sample in a single scan (&lt;1 h). The described approach takes advantage of recent developments in data-dependent acquisition and data-independent acquisition, using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. The measurement of SIL at the fatty acid chain level reveals changes in lipid dynamics during the ovary development of mosquitoes. The lipids de novo structures are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

Presented here is a method for screening lipid structures through stable isotope labeling by using their retention time, mobility, and fragmentation.