نشكر أعضاء مختبر Meffert على المناقشات المفيدة ، بما في ذلك BH Powell و WT Mills IV ، على التعليقات النقدية حول وصف تركيب وتنفيذ خط الأنابيب. تم دعم هذا العمل من خلال جائزة مؤسسة Braude ، وبرنامج إطلاق صندوق أبحاث الخلايا الجذعية في ماريلاند ، وجائزة Blaustein Endowment for Pain Research and Education ، و NINDS RO1NS103974 و NIMH RO1MH129292 إلى M.K.M.

ملاحظة: سيبدأ البروتوكول بتنزيل وتثبيت البرامج المطلوبة لتحليل مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي باستخدام SCRAP.
1. التثبيت
<ol><li>قبل تثبيت SCRAP ، قم بتثبيت التبعيات Git و Miniconda على الجهاز المراد استخدامه في التحليلات. من المحتمل أن يكون Git مثبتا بالفعل. على نظام Mac OSX الأساسي ، على سبيل المثال ، تحقق من ذلك باستخدام أي بوابة لمعرفة أن الأداة المساعدة "git" موجودة ومثبتة في هذا الدليل. تحقق مما إذا تم تثبيت Miniconda باستخدام أي كوندا. إذا لم يتم إرجاع أي شيء ، فقم بتثبيت Miniconda. يتطلب Miniconda 400 ميغابايت من مساحة القرص للتثبيت.<ol><li>هناك عدة طرق لتثبيت Miniconda ، وهي تختلف حسب النظام الأساسي. ارجع إلى ملف تخفيض السعر PLATFORM-SETUP في مستودع Meffert Lab GitHub [https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] حيث توجد إرشادات أخرى للتثبيت على أنظمة التشغيل Windows و MacOS و Ubuntu. بالنسبة لمستخدمي Linux ، يحتوي Linux على مدير الحزم الافتراضي الخاص به (apt). في الحالة الخاصة بهذه الدراسة ، استخدم الأمر brew install Miniconda لتثبيت Miniconda باستخدام مدير حزم موجود ، الشراب. ملاحظة: "Homebrew" ، المسمى "brew" هو نظام إدارة حزم برامج مفتوح المصدر يبسط تثبيت البرامج على نظام تشغيل Apple ، macOS.</li>
		<li>إذا تم تثبيت conda لأول مرة ، فقم بتشغيل conda init للقذيفة المعينة قيد الاستخدام. في المثال هنا ، هذه القشرة المستخدمة هي zsh. ثم أغلق القشرة وأعد فتحها. إذا تم تثبيت conda بنجاح ، فستظهر البيئة الأساسية التي تم تنشيطها داخل الجلسة الطرفية.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بتنزيل مصدر SCRAP وقم بتثبيت تبعياته.<ol><li>الطريقة المفضلة للحصول على مصدر SCRAP هي استخدام Git. قم بالوصول إلى هذا عن طريق تشغيل git clone https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP للحصول على أحدث نسخة من شفرة المصدر.</li>
		<li>قم بتثبيت mamba ، وهو حل حزم محسن ل conda ، وقم بتثبيت جميع تبعيات SCRAP من SCRAP_environment.yml إلى بيئة conda الخاصة بها باستخدام الأوامر التالية: تثبيت كوندا -N قاعدة كوندا فورج :: مامبا مامبا البيئة إنشاء -f SCRAP / SCRAP_environment.yml -n SCRAP</li>
	</ol></li>
	<li>بعد ذلك ، قم بتشغيل التثبيت المرجعي ل SCRAP. ستكون الحجج المستخدمة في التثبيت المرجعي خاصة بالكائن الحي الذي يتم تحليل تفاعلات sncRNA-mRNA الخاصة به. باش سكراب / بن / Reference_Installation.sh -r كامل / مسار / إلى / خردة / -م لديه -g hg38 -s الإنسان
	<ol><li>قم بتوفير دليل المجلد المصدر SCRAP للتثبيت المرجعي. سيتم بعد ذلك تنفيذ خطوات التثبيت باستخدام الملفات الموجودة داخل مجلدات fasta والتعليقات التوضيحية. ضع قائمة بالمسار الكامل دون أي اختزال. تنتهي بشرطة مائلة.</li>
		<li>ارجع إلى الجداول الموجودة في README.md للحصول على اختصارات أنواع miRbase الصحيحة. يمكن العثور على الجينومات المرجعية الحديثة في https://genome.ucsc.edu/ أو https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/. في هذا المثال ، سيتم استخدام hg38 لجينوم الماوس GRCm38.</li>
		<li>الأنواع المدرجة حاليا للتعليق التوضيحي هي الإنسان والفأر والدودة. عرض ملفات species.annotation.bed المقابلة في دليل التعليقات التوضيحية في المجلد المصدر SCRAP. إذا كان استخدام نوع مختلف للتحليل مطلوبا ، فقم بتوفير ملف annotation.bed يتبع نفس نظام التسمية species.annotation.bed.</li>
	</ol></li>
</ol>2. تشغيل الخردة
<ol><li>الآن بعد تثبيت التبعيات و SCRAP ، - قم بتشغيل البرنامج النصي SCRAP.sh باش سكراب / بن / SCRAP.sh -د كامل / مسار / إلى / CLASH_Human / - كامل / مسار / إلى / CLASH_Human / CLASH_Human_Adapters.txt -p لا -f نعم -r كامل / مسار / إلى / خردة / -m لديه -g hg38
	<ol><li>سرد المسار بأكمله إلى أدلة العينة دون أي اختزال. قم بتنسيق نماذج الدلائل بحيث يتطابق اسم المجلد مع اسم العينة تماما ، كما هو موضح في الشكل 1.</li>
		<li>لاحظ أن المسار المدرج هو المسار إلى الدليل الذي يحتوي على كافة مجلدات العينة، وليس المسار إلى أي مجلد نموذج فردي أو ملف نموذج (راجع سطر الأوامر في الخطوة 2.1).</li>
		<li>بعد ذلك ، قم بإدراج المسار بالكامل إلى ملف المحول. تأكد من تطابق أسماء النماذج في ملف المحول مع أسماء المجلدات وأسماء الملفات المذكورة سابقا (راجع سطر الأوامر في الخطوة 2.1).</li>
		<li>حدد ما إذا كانت العينات مقترنة وما إذا كان سيتم إجراء ترشيح ل pre-miRNAs و / أو tRNAs أم لا. أضف مرشحا لتنظيف rRNA إذا رغبت في ذلك (راجع سطر الأوامر في الخطوة 2.1). ملاحظة: قد يقرر المستخدمون أو لا يقررون استخدام هذه المرشحات اعتمادا على أنواع العينات والأهداف التجريبية. اعتمادا على التصميم التجريبي ، يمكن أن تستهلك ما قبل miRNAs و tRNAs و rRNAs عمق التسلسل المتاح ل sncRNA الحقيقي: خيالات الحمض النووي الريبي المستهدفة ويمكن للمستخدمين استخدام المرشحات لاستبعادها. ومع ذلك ، قد يرغب المستخدمون في تجنب مثل هذا الترشيح في ظروف معينة (على سبيل المثال ، تعيين أهداف sncRNA إلى جينوم الميتوكوندريا ، الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي للميتوكوندريا).</li>
		<li>بعد ذلك ، قم بإدراج المسار بالكامل إلى الدليل المرجعي واختصار miRbase واختصار الجينوم المرجعي (راجع سطر الأوامر في الخطوة 2.1). ملاحظة: قد يستغرق البرنامج النصي بضع ساعات لإكمال، اعتمادا على حجم مجموعة البيانات ووحدة المعالجة المركزية للكمبيوتر المستخدم.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ذروة الاتصال والتعليق التوضيحي
<ol><li>بمجرد الانتهاء من تشغيل SCRAP ، تحقق من أن الإخراج يتضمن ، من بين ملفات أخرى ، ملف SAMPLE.aligned.unique.bam. هذا ملف ثنائي يحتوي على محاذاة الحمض النووي الريبي المستهدف على الجينوم المرجعي المقدم من المستخدم.</li>
	<li>الآن قم بإجراء مكالمات الذروة عن طريق تشغيل Peak_Calling.sh. باش سكراب / بن / Peak_Calling.sh -د CLASH_Human / -أ CLASH_Human / CLASH_Human_Adapters.txt -c 3 -l 2 -f no -r SCRAP / -m has -g hg38 ملاحظة: استدعاء الذروة هو سمة من سمات SCRAP ، والتي تم تصميمها للسماح للباحثين بتقييم تفاعلات الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة الأكثر قوة وقابلية للتكرار: تفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدفة داخل مكتبات الحمض النووي الريبي الوهمية الخاصة بهم. هذه الميزة ، على سبيل المثال ، يمكن أن تساعد الباحثين في تحديد التفاعلات التي قد يرغبون في تحديدها لمزيد من التحقيق. تصف الخطوة 3.2.2 أدناه كيف يحدد المستخدم المعايير التي يريد استخدامها لتحديد الصرامة التي تسمى بها الذروة - وهذا يشمل عدد التفاعلات الفريدة ، أو قراءات التسلسل ، والتي يجب أن تكون قد حدثت حتى يتم استدعاء الذروة ، بالإضافة إلى عدد المكتبات التي يجب أن يكون هذا التفاعل المحدد قد حدث فيها.<ol><li>مرة أخرى ، قم بسرد المسارات الكاملة إلى الدليل الذي يحتوي على مجلدات العينة وملف المحول (راجع سطر الأوامر في الخطوة 3.2).</li>
		<li>بعد ذلك ، قم بتعيين الحد الأدنى لعدد قراءات التسلسل المطلوبة لاستدعاء الذروة (راجع سطر الأوامر في الخطوة 3.2).</li>
		<li>قم بتعيين الحد الأدنى لعدد مكتبات التسلسل المميزة التي يجب أن تحتوي على ذروة حتى يتم استدعاؤها (راجع سطر الأوامر في الخطوة 3.2). ملاحظة: يعتمد اختيار القيم لكل من 3.2.2 و 3.2.3 على طبيعة العينات المتسلسلة وعدد العينات أو أنواع العينات. هنا ، يلزم ما لا يقل عن 3 قراءات تسلسل خيمري في عينة لاستدعاء الذروة ، ويجب أن تكون الذروة مدعومة بعينات 2 على الأقل. قد يقرر المحقق الذي يقوم بتقييم مجموعة بيانات بها العديد من النسخ المتماثلة لمكتبة التسلسل لحالة معينة ، على سبيل المثال ، طلب وجود القراءات في عدد أكبر من مكتبات تسلسل العينات.</li>
		<li>وضح ما إذا كان يجب أن تساهم sncRNAs من نفس العائلة في نفس الذروة. على سبيل المثال ، نظرا لأن miRNAs من نفس العائلة تشترك في تسلسل البذور ، يمكن لهذه miRNAs ربط مجموعات مشتركة ومتداخلة من أهداف الجينات. قد يرغب المستخدم في تحديد التأثير الكامل للعائلة على هذه الأهداف من خلال تقييم ذروتها الجماعية (راجع سطر الأوامر في الخطوة 3.2).</li>
		<li>بعد ذلك ، أشر إلى المسار الكامل للدليل المرجعي واختصار miRBase واختصار الجينوم المرجعي (راجع سطر الأوامر في الخطوة 3.2).</li>
	</ol></li>
	<li>بمجرد اكتمال ذروة الاتصال، قم بتشغيل التعليق التوضيحي لذروة الاتصال. باش سكراب / بن / Peak_Annotation.sh -p CLASH_Human / peaks.bed -r SCRAP / -s الإنسان
	<ol><li>قم بإدراج المسار الكامل إلى ملف peaks.bed (أو peaks.family.bed) الناتج من استدعاء الذروة والمسار الكامل إلى الدليل المرجعي والأنواع المطلوبة للتعليق التوضيحي.</li>
	</ol></li>
</ol>4. تصور البيانات
ملاحظة: تم الآن إكمال جميع خطوات التحليل باستخدام SCRAP. لتصور البيانات ، يوصى بعدة طرق:
<ol><li>دمج كافة ملفات .bam (ملف SAM الثنائي) التي ستكون مطلوبة للتصور معا (دمج samtools).</li>
	<li>قم بفرز ملف .bam المدمج الناتج (فرز samtools). يتم فرز محتويات الملف سطرا بسطر بحيث يمكن فهرسة samtools.</li>
	<li>فهرسة ملف .bam الذي تم فرزه (فهرس samtools). يتم إنشاء ملف BAI (فهرس تنسيق samtools الثنائي) للسماح بالتصور في عارض الجينوم التكاملي (IGV).</li>
	<li>أخيرا ، افتح ملف .bam الذي تم فرزه وملف .bai المفهرس في IGV. ملاحظة: SncRNA: قد تكون تفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدفة ذات الاهتمام ذات أولوية للمتابعة بعدد من الطرق الخاصة بالتحقيق. يتمثل أحد الأساليب الأولية العامة في تقييم التفاعلات التي يتم دعم القمم من خلال قراءات التسلسل الأكثر وهمية. يمكن أيضا تصور التفاعلات ذات الأهمية باستخدام خادم الويب DuplexFold من حزمة RNAstructure عن طريق إدخال تسلسل كل من sncRNA والحمض النووي الريبي المستهدف من التفاعل المكتشف11. لكل ذروة ، يمكن العثور على الكروموسوم (العمود الأول) والإحداثيات الجينومية (البداية: 1st العمود end: 2nd column) داخل ملف peaks.bed.species.annotation.txt الذي تم إنشاؤه في التعليق التوضيحي للذروة. بالنسبة ل miRNAs على وجه الخصوص ، في حين أن التفاعلات القابلة للتكرار والوظيفية يمكن أن تفتقر إلى الارتباط المطابق للبذور (على سبيل المثال ، قد تستخدم التفاعلات الارتباط التعويضي 3 بوصات) ، يمكن مع ذلك تقييم وجود مواقع مطابقة للبذور في شكل ربط مشابه للحمض النووي الريبي المستهدف كميزة تحقق من صحة التفاعلات المكتشفة المهمة وظيفيا 4,12. يمكن أن تشمل معالجة البيانات المساعدة مقارنات لتغطية القراءة التفاضلية بين القمم في ظروف بيولوجية متميزة وتقييم محتمل لتجميع الجينات المنظمة في مسارات باستخدام أداة تحليل المسار.</li>
</ol>

في الجسم الحي RNA: تفاعلات الحمض النووي الريبي باستخدام خط أنابيب المعلوماتية الحيوية SCRAP

<ol>
	<li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+regulatory+RNA.">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li><li>Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+noncoding+RNAs+of+local+translation,+injury+responses,+and+pain+in+the+peripheral+nervous+system.">Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury responses, and pain in the peripheral nervous system.</a> Neurobiology of Pain (Cambridge, Mass.). 13, 100119 (2023).</li><li>Shi, J., Zhou, T., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+expanding+universe+of+small+RNAs.">Exploring the expanding universe of small RNAs.</a> Nature Cell Biology. 24 (4), 415-423 (2022).</li><li>Broughton, J. P., Lovci, M. T., Huang, J. L., Yeo, G. W., Pasquinelli, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairing+beyond+the+seed+supports+microRNA+targeting+specificity.">Pairing beyond the seed supports microRNA targeting specificity.</a> Molecular Cell. 64 (2), 320-333 (2016).</li><li>Grosswendt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unambiguous+identification+of+miRNA:target+site+interactions+by+different+types+of+ligation+reactions.">Unambiguous identification of miRNA:target site interactions by different types of ligation reactions.</a> Molecular Cell. 54 (6), 1042-1054 (2014).</li><li>Mills, W. T., Eadara, S., Jaffe, A. E., Meffert, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCRAP:+a+bioinformatic+pipeline+for+the+analysis+of+small+chimeric+RNA-seq+data.">SCRAP: a bioinformatic pipeline for the analysis of small chimeric RNA-seq data.</a> RNA. 29 (1), 1-17 (2023).</li><li>Helwak, A., Kudla, G., Dudnakova, T., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+human+miRNA+interactome+by+CLASH+reveals+frequent+noncanonical+binding.">Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding.</a> Cell. 153 (3), 654-665 (2013).</li><li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis.">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li><li>Moore, M. J., Zhang, C., Gantman, E. C., Mele, A., Darnell, J. C., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis.">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li><li>Bjerke, G. A., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+directly+captured+microRNA+targets+reveals+the+impact+of+microRNAs+on+mammalian+transcriptome.">Integrated analysis of directly captured microRNA targets reveals the impact of microRNAs on mammalian transcriptome.</a> RNA. 26 (3), 306-323 (2020).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11 (1), 129 (2010).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-target+chimeras+reveal+miRNA+3&#8242;-end+pairing+as+a+major+determinant+of+Argonaute+target+specificity.">miRNA-target chimeras reveal miRNA 3&#8242;-end pairing as a major determinant of Argonaute target specificity.</a> Nature Communications. 6 (1), 8864 (2015).</li><li>Travis, A. J., Moody, J., Helwak, A., Tollervey, D., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyb:+a+bioinformatics+pipeline+for+the+analysis+of+CLASH+(crosslinking,+ligation+and+sequencing+of+hybrids)+data.">Hyb: a bioinformatics pipeline for the analysis of CLASH (crosslinking, ligation and sequencing of hybrids) data.</a> Methods (San Diego, Calif.). 65 (3), 263-273 (2014).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تم تصميم هذا البروتوكول الخاص باستخدام خط أنابيب SCRAP لتحليل تفاعلات sncRNA: RNA المستهدفة لمساعدة الباحثين الذين يدخلون في التحليل الحسابي. من المتوقع أن يؤدي إكمال البرنامج التعليمي إلى توجيه الباحثين ذوي الخبرة الحسابية للمبتدئين أو أكبر من خلال الخطوات المطلوبة لتثبيت واستخدام خط الأنابي...

تمت دراسة الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر بدرجة عالية لأدوارها بعد النسخ في تنسيق التعبير من مجموعات الجينات في عمليات متنوعة مثل التمايز والتطوير ومعالجة الإشارات والمرض1،2،3. تعد القدرة على تحديد النصوص المستهدفة بدقة للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (sncRNAs) ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي الصغير (miRNAs) ، ذات أهمية لدراسات بيولوجيا الحمض النووي الريبي على المستويين الأساسي والانتقالي. تم استخدام خوارزميات المعلوماتية الحيوية التي تستغل التكامل المتوقع بين تسلسل بذور miRNA وأهدافه المحتملة بشكل متكرر للتنبؤ بتفاعلات miRNA: الحمض النووي الريبي المستهدف. في حين أن هذه الخوارزميات المعلوماتية الحيوية كانت ناجحة ، إلا أنها يمكن أن تؤوي أيضا نتائج إيجابية خاطئة وسلبية خاطئة ، كما تمت مراجعته في مكان آخر4،5،6. في الآونة الأخيرة ، تم تصميم وتنفيذ العديد من الأساليب الكيميائية الحيوية التي تسمح بتحديد لا لبس فيه وشبه كمي لتفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي: تفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدفة عن طريق التشابك في الجسم الحي وما يترتب على ذلك من دمج خطوة ربط لربط sncRNA فعليا بهدفه لتشكيل RNA خيمري واحد4،5،7،8،9،10. يسمح الإعداد اللاحق لمكتبات التسلسل من الحمض النووي الريبي الوهمي بتقييم تفاعلات sncRNA: الحمض النووي الريبي المستهدف عن طريق المعالجة الحسابية لبيانات التسلسل. يوفر هذا الفيديو برنامجا تعليميا لتثبيت واستخدام خط أنابيب حسابي يسمى خط أنابيب تحليل الحمض النووي الريبي الوهمي الصغير (SCRAP) ، والذي تم تصميمه للسماح بتحليل قوي وقابل للتكرار لتفاعلات sncRNA: الهدف من تفاعلات الحمض النووي الريبي من مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي6.
الهدف من هذا البرنامج التعليمي هو مساعدة الباحثين في تجنب الاعتماد المفرط على خوارزميات المعلوماتية الحيوية التنبؤية البحتة عن طريق تقليل الحواجز أمام تحليل البيانات الناتجة عن الأساليب الكيميائية الحيوية التي توفر قراءات جزيئية وهمية لتفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدف: sncRNA. يوفر هذا البرنامج التعليمي خطوات ونصائح عملية لتوجيه علماء الحوسبة المبتدئين من خلال استخدام خط أنابيب ، SCRAP ، تم تطويره لتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الخيمري ، والتي يمكن إنشاؤها بواسطة العديد من البروتوكولات البيوكيميائية الحالية ، بما في ذلك التشابك والربط وتسلسل الهجينة (CLASH) والربط التساهمي للحمض النووي الريبي الداخلي المرتبط ب Argonaute - التشابك والترسيب المناعي (CLEAR-CLIP) 7,9.
يوفر استخدام SCRAP العديد من المزايا لتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي ، مقارنة بخطوط الأنابيب الحسابية الأخرى6. تتمثل إحدى المزايا البارزة في التعليق التوضيحي الشامل ودمج الاستدعاءات إلى نصوص المعلوماتية الحيوية المدعومة جيدا والمحدثة بشكل روتيني داخل خط الأنابيب ، مقارنة بخطوط الأنابيب البديلة التي تعتمد غالبا على البرامج النصية المخصصة و / أو غير المدعومة للخطوات في خط الأنابيب. تضفي هذه الميزة الاستقرار على SCRAP ، مما يجعلها أكثر جدوى للباحثين للتعرف على خط الأنابيب ودمج استخدامه في سير عملهم. كما ثبت أن SCRAP يتفوق على خطوط الأنابيب البديلة في استدعاء قمم sncRNA: تفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدف ولديه وظائف عبر الأنظمة الأساسية ، كما هو مفصل في منشور سابق6.
بنهاية هذا البرنامج التعليمي ، سيتمكن المستخدمون من (i) معرفة متطلبات النظام الأساسي ل SCRAP وتثبيت خطوط أنابيب SCRAP ، (ii) تثبيت الجينومات المرجعية وإعداد معلمات سطر الأوامر ل SCRAP ، و (iii) فهم معايير استدعاء الذروة وإجراء ذروة الاتصال والتعليق التوضيحي للذروة.
سيصف هذا الفيديو بالتفصيل العملي كيف يمكن للباحثين الذين يدرسون بيولوجيا الحمض النووي الريبي تثبيت واستخدام خط الأنابيب الحسابي ، SCRAP ، على النحو الأمثل لتحليل تفاعلات sncRNA مع الحمض النووي الريبي المستهدف ، مثل الحمض النووي الريبي المرسال ، في بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمية التي تم الحصول عليها من خلال أحد الأساليب الكيميائية الحيوية التي تمت مناقشتها لإعداد مكتبة التسلسل.
SCRAP هي أداة مساعدة لسطر الأوامر. بشكل عام ، باتباع الدليل أدناه ، سيحتاج المستخدم إلى (i) تنزيل وتثبيت SCRAP (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP) ، (ii) تثبيت الجينومات المرجعية وتشغيل SCRAP ، و (iii) إجراء ذروة الاتصال والتعليقات التوضيحية.
يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول الخطوات الحسابية في هذا الإجراء في https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP. ستوفر هذه المقالة معلومات الإعداد والخلفية للسماح للمحققين ذوي المهارات الحسابية للمبتدئين بتثبيت SCRAP وتحسينه واستخدامه على مجموعات بيانات مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Genomes</td>
			<td>UCSC Genome browser</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/ or https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux</td>
			<td>Linux</td>
			<td>Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS recommended</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Mac OSX (&#62;11)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platform setup</td>
			<td>GitHub</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCRAP pipeline</td>
			<td>GitHub</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unix shell</td>
			<td>Unix operating system</td>
			<td>bash &#62;=5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unix shell</td>
			<td>Unix operating system</td>
			<td>zsh (5.9 recommended)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows</td>
			<td>Windows</td>
			<td>WSL Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computational analysis tutorial for chimeric small noncoding rna: target rna sequencing libraries

تم تطوير فهم التفاعلات التنظيمية الجينية في الجسم الحي للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (sncRNAs) ، مثل microRNAs (miRNAs) ، مع الحمض النووي الريبي المستهدف في السنوات الأخيرة من خلال الأساليب الكيميائية الحيوية التي تستخدم الربط المتقاطع متبوعا بالربط لالتقاط sncRNA: تفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدفة من خلال تكوين الحمض النووي الريبي الوهمي ومكتبات التسلسل اللاحقة. في حين أن مجموعات البيانات من تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي توفر مدخلات على مستوى الجينوم وأقل غموضا إلى حد كبير من برامج التنبؤ miRNA ، فإن تقطير هذه البيانات إلى معلومات ذات مغزى وقابلة للتنفيذ يتطلب تحليلات إضافية وقد يثني الباحثين الذين يفتقرون إلى خلفية حسابية. يقدم هذا التقرير برنامجا تعليميا لدعم علماء الأحياء الحاسوبية للمبتدئين في تثبيت وتطبيق أداة برمجية حديثة مفتوحة المصدر: خط أنابيب تحليل الحمض النووي الريبي الخيمري الصغير (SCRAP). يتم توفير متطلبات النظام الأساسي والتحديثات وشرح خطوات خط الأنابيب ومعالجة متغيرات إدخال المستخدم الرئيسية. إن تقليل الحاجز أمام علماء الأحياء لاكتساب رؤى من مناهج تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي لديه القدرة على بدء التحقيقات القائمة على الاكتشاف لتفاعلات الحمض النووي الريبي (sncRNA) التنظيمية: تفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدفة في سياقات بيولوجية متعددة.

Small noncoding RNAs are highly studied for their post-transcriptional roles in coordinating expression from suites of genes in diverse processes such as differentiation and development, signal processing, and disease1,2,3. The ability to accurately determine the target transcripts of gene-regulatory small noncoding RNAs (sncRNAs), including microRNAs (miRNAs), is of importance to studies of RNA biology at both basic and translational levels. Bioinformatic algorithms that exploit anticipated complementarity between the miRNA seed sequence and its potential targets have been frequently used for the prediction of miRNA:target RNA interactions. While these bioinformatic algorithms have been successful, they also can harbor both false positive and false negative results, as has been reviewed elsewhere4,5,6. Recently, several biochemical approaches have been designed and implemented that allow unambiguous and semiquantitative determination of in vivo sncRNA:target RNA interactions by in vivo crosslinking and ensuing incorporation of a ligation step to physically attach the sncRNA to its target to form a single chimeric RNA4,5,7,8,9,10. Subsequent preparation of sequencing libraries from the chimeric RNAs allows assessment of the sncRNA:target RNA interactions by computational processing of the sequencing data. This video provides a tutorial for installing and using a computational pipeline termed small chimeric RNA analysis pipeline (SCRAP), which is designed to allow robust and reproducible analysis of sncRNA:target RNA interactions from chimeric RNA sequencing libraries6.
A goal of this tutorial is to assist investigators in avoiding excessive reliance on purely predictive bioinformatic algorithms by lowering barriers to the analysis of data generated through biochemical approaches providing chimeric molecular readouts of sncRNA:target RNA interactions. This tutorial provides practical steps and tips to guide entry-level computational scientists through the use of a pipeline, SCRAP, developed for analyzing chimeric RNA sequencing data, which can be generated by several existing biochemical protocols, including crosslinking, ligation, and sequencing of hybrids (CLASH) and covalent ligation of endogenous Argonaute-bound RNAs- crosslinking and immunoprecipitation (CLEAR-CLIP)7,9.
The use of SCRAP offers several advantages for the analysis of chimeric RNA sequencing data, compared to other computational pipelines6. One salient advantage is its extensive annotation and the incorporation of call-outs to well-supported and routinely updated bioinformatic scripts within the pipeline, in comparison to alternative pipelines that often rely on custom and/or unsupported scripts for steps in the pipeline. This feature lends stability to SCRAP, making it more worthwhile for researchers to familiarize themselves with the pipeline and to incorporate its use into their workflow. SCRAP has also been demonstrated to outperform alternative pipelines in calling peaks of sncRNA:target RNA interactions and to have cross-platform functionality, as detailed in a prior publication6.
By the end of this tutorial, users will be able to (i) know platform requirements for SCRAP and install SCRAP pipelines, (ii) install reference genomes and set up command line parameters for SCRAP, and (iii) understand peak calling criteria and perform peak calling and peak annotation.
This video will describe in practical detail how researchers studying RNA biology may install and optimally use the computational pipeline, SCRAP, to analyze sncRNA interactions with target RNAs, such as messenger RNAs, in chimeric RNA-sequencing data obtained through one of the discussed biochemical approaches to sequencing library preparation.
SCRAP is a command line utility. Generally, following the guide below, the user will need to (i) download and install SCRAP (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP), (ii) Install reference genomes and run SCRAP, and (iii) perform peak calling and annotation.
Further details of the computational steps in this procedure can be found at&#160;https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP. This article will provide the setup and background information to allow investigators with entry-level computational skills to install, optimize, and use SCRAP on chimeric RNA sequencing library datasets.

تسليط الضوء على المؤلف: خط أنابيب حسابي لتحليل تفاعلات الحمض النووي الريبي غير المشفرة في بيانات التسلسل عالية الإنتاجية 

برنامج تعليمي للتحليل الحسابي للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر الوهمي: مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي المستهدفة

This protocol covers the installation and practical steps for the use of a computational pipeline designed to analyze high throughput sequencing data from chimeric noncoding RNA-target RNA-interactions. The molecular strategy to form chimeric RNAs is a relatively recent development that has advantages when compared to prior biochromatic prediction tools in unambiguously understanding the genome-wide noncoding RNA-target RNA-interaction landscape. Sequencing data generated from the high throughput sequencing of the chimeric RNAs can present an analysis challenge for new adopters of this strategy.We have established an open source cross-platform computational pipeline that is highly annotated to allow entry-level users to analyze data from their chimeric noncoding RNA-target RNA sequencing experiments. In future experiments, the Mefford lab plans to use computational analysis by scrap on dataset generated from our ongoing investigations into post transcriptional regulation in the mammalian nervous system, as well as to maintain an update scrap on our GitHub.

نتائج sncRNA: يظهر الحمض النووي الريبي المستهدف المكتشف بواسطة نسخة معدلة من SCRAP (إصدار SCRAP 2.0 ، الذي ينفذ تعديلات لتصفية rRNA) على مجموعات بيانات التسلسل المنشورة مسبقا والتي تم إعدادها باستخدام CLEAR-CLIP9 في الشكل 2 والجدول 1. يمكن للمستخدمين تقدير الانخفاض في ...

Watch this Scientific Journal Video about A Computational Pipeline for Analyzing Chimeric Noncoding RNA-Target RNA Interactions in High-Throughput Sequencing Data at JoVE.com

هنا ، نقدم بروتوكولا يوضح تركيب واستخدام خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي المستخدمة في دراسة تفاعلات الحمض النووي الريبي: الحمض النووي الريبي في الجسم الحي .

An understanding of the in vivo gene regulatory interactions of small noncoding RNAs (sncRNAs), such as microRNAs (miRNAs), with their target RNAs has ...

يغطي هذا البروتوكول التثبيت والخطوات العملية لاستخدام خط أنابيب حسابي مصمم لتحليل بيانات التسلسل عالية الإنتاجية من تفاعلات الحمض النووي الريبي غير المشفرة الوهمية. تعد الإستراتيجية الجزيئية لتشكيل الحمض النووي الريبي الوهمي تطورا حديثا نسبيا له مزايا عند مقارنته بأدوات التنبؤ بالألوان الحيوية السابقة في فهم لا لبس فيه لمشهد تفاعل الحمض النووي الريبي المستهدف على مستوى الجينوم. يمكن أن تمثل بيانات التسلسل الناتجة عن التسلسل عالي الإنتاجية للحمض النووي الريبي الوهمي تحديا تحليليا للمتبنين الجدد لهذه الاستراتيجية.لقد أنشأنا خط أنابيب حسابي مفتوح المصدر عبر الأنظمة الأساسية مشروح للغاية للسماح للمستخدمين المبتدئين بتحليل البيانات من تجارب تسلسل الحمض النووي الريبي غير المشفرة غير المشفرة. في التجارب المستقبلية ، يخطط مختبر Mefford لاستخدام التحليل الحسابي عن طريق الخردة على مجموعة البيانات الناتجة عن تحقيقاتنا المستمرة في تنظيم ما بعد النسخ في الجهاز العصبي للثدييات ، بالإضافة إلى الحفاظ على خردة التحديث على GitHub الخاص بنا.

computational-analysis-tutorial-for-chimeric-small-noncoding-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Computational Analysis Tutorial for Chimeric Small Noncoding RNA: Target RNA Sequencing Libraries

419 Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. يغطي هذا البروتوكول التثبيت والخطوات العملية لاستخدام خط أنابيب حسابي مصمم لتحليل بيانات التسلسل عالية الإنتاجية من تفاعلات الحمض النووي الريبي غير المشفرة الوهمية. تعد الإستراتيجية الجزيئية لتشكيل الحمض النووي الريبي الوهمي تطورا حديثا نسبيا له مزايا عند مقارنته بأدو?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: خط أنابيب حسابي لتحليل تفاعلات الحمض النووي الريبي غير المشفرة في بيانات التسلسل عالية الإنتاجية 

An understanding of the in vivo gene regulatory interactions of small noncoding RNAs (sncRNAs), such as microRNAs (miRNAs), with their target RNAs has been advanced in recent years by biochemical approaches which use cross-linking followed by ligation to capture sncRNA:target RNA interactions through the formation of chimeric RNAs and subsequent sequencing libraries. While datasets from chimeric RNA sequencing provide genome-wide and substantially less ambiguous input than miRNA prediction software, distilling this data into meaningful and actionable information requires additional analyses and may dissuade investigators lacking a computational background. This report provides a tutorial to support entry-level computational biologists in installing and applying a recent open-source software tool: Small Chimeric RNA Analysis Pipeline (SCRAP). Platform requirements, updates, and an explanation of pipeline steps and manipulation of key user-input variables is provided. Reducing a barrier for biologists to gain insights from chimeric RNA sequencing approaches has the potential to springboard discovery-based investigations of regulatory sncRNA:target RNA interactions in multiple biological contexts.

Here, we present a protocol demonstrating the installation and use of a bioinformatics pipeline to analyze chimeric RNA sequencing data used in the study of in vivo RNA:RNA interactions.

Installing and Running SCRAP for Small Noncoding RNA-mRNA Interaction Analysis

Before initiating SCRAP installation on the Mac OSX platform, execute the command which git in the terminal to confirm the existence of Git. To verify Miniconda installation, type which conda in the terminal. To install Miniconda, refer to the Platform Setup markdown file on the Meffert Lab GitHub Repository for instructions to install on Windows, Mac OS, and Ubuntu For Mac systems, using the Home Brew Package Manager, use the command brew install miniconda to install Miniconda.To install Conda, run conda init, specifying the shell in use, then close and reopen the shell. A successful installation displays the base environment activated within the terminal session. Next, run the indicated git clone to obtain the latest copy of the SCRAP source code.Install Mamba, an improved package solver for Conda. Using the following command, install all the dependencies for SCRAP from SCRAP_environment. yml to its own Conda environment.Next, use the indicated bash script, specific to the organism whose SNC RNA mRNA interactions are analyzed for SCRAP. Provide the directory of the SCRAP source folder and perform the installation steps using the files within the FASTA and annotation folders. Ensure the directory path is complete and ends with a slash.Refer to the tables in ReadMe. md for the correct miRBase species abbreviations. For updated reference genome, use the UCSC Genome Browser or the NCBI Genome Data Hub.Inspect the corresponding species.annotation. bed files in the annotation directory in the SCRAP source folder. If there's a need to analyze a different species, provide an indicated file.After installing dependencies and SCRAP, use the indicated script to initiate SCRAP analysis with the specified command structure. List the full path to the sample directories without any shorthand and format the sample directories with the folder name matching the sample name. Emphasize that the path listed leads to the directory containing all the sample folders and not to an individual sample folder or file.Next, list the entire path to the adapter file. Verify that the sample names in the adapter file match the previously mentioned folder names and file names. Specify the sample type, either paired end or single end, and state the choice of RNA filters for pre-mRNAs, tRNAs, and optionally RNA cleaning.List the entire path to the reference directory. miRBase abbreviation and the reference genome abbreviation.

تركيب وتشغيل SCRAP لتحليل تفاعل RNA-mRNA الصغير غير المشفر

Peak Calling and Annotation in SCRAP for Small Noncoding RNA: Target RNA Interaction Studies

After running SCRAP, use the indicated script command to perform peak calling. List the full paths to the directory containing the sample folders and the adapter file. Then, define the criteria for peak calling, including the minimum number of sequencing reads, and the number of distinct sequencing libraries needed for a peak to be recognized.Indicate whether peaks must be contributed to by sncRNAs of the same family, which is relevant for miRNAs that share seed sequences and can bind to overlapping gene targets. Then, indicate the full path to the reference directory, MIR base abbreviation, and the reference genome abbreviation. After peak calling, run the peak annotation script.Provide the full path to the resulting peaks. bed from the peak calling to the reference directory and the desired species for annotation. Use samtools merge to merge all the desired bam files to facilitate combined visualization.Then, use the samtools sort for line-by-line sorting of merged. bam file. Index the sorted.bam file using the samtools index, generating a binary samtools format index file required for genomic visualization tools. Finally, in the integrative genomics viewer, open the sorted. bam and indexed.by file. The application of a modified version of SCRAP to previously published sequencing data sets revealed a decrease in miRNA interactions with Intron regions. The reduction was observed after isolating high confidence interactions through peak calling with SCRAP.