تواجه غابات عشب البحر خسائر غير مسبوقة بسبب الضغوطات البيئية الناجمة عن المناخ والتحولات في الديناميات الغذائية. يوضح هذا الفيديو بروتوكولا وأدوات لاستزراع عشب البحر العملاق ، Macrocystis pyrifera ، باستخدام تقنية الحصى الأخضر ، ويوفر موردا قيما لمزيد من التجارب لمعالجة نجاحات وقيود هذه الطريقة في بيئات مختلفة. يجب أن تكون مرافق زراعة عشب البحر قادرة على التحكم في درجات حرارة تتراوح بين 10 و 15 درجة مئوية ، وتوفير ضوء كامل الطيف يتراوح بين صفر و 180 ميكرومول فوتونات لكل متر مربع من الثانية ، وتهوية مرشحة.
يمكن تكييف أنظمة الحاضنة ذات المنفذ المدمج أو منفذ الوصول للأسلاك والأنابيب مع الأضواء ومصدر الهواء. إذا لم يكن نظام الحاضنة ضمن نطاق المشروع أو ميزانيته أو نطاقه المقصود ، فيمكن استخدام حمامات مائية مخففة إما بمياه البحر الطبيعية الباردة أو المبرد. درجات حرارة التربية خاصة بالموقع والموسم.
ضع مقياس حرارة في وسائط النمو ، أو استخدم مسدس درجة الحرارة للتأكد من أن درجة الحرارة تتراوح بين 10 و 18 درجة مئوية. اضبط أضواء الطيف الكامل على ضوء لمدة 12 ساعة ، وفترة صور مظلمة لمدة 12 ساعة باستخدام إعدادات التوقيت على مصدر الضوء ، أو عن طريق توصيل مصدر الضوء بمؤقت بدورة قابلة للبرمجة. قم بقياس شدة الضوء باستخدام مقياس كم PAR تحت السطح بالقرب من الحصى واضبطه باستخدام مصدر ضوء قابل للتعتيم ، أو عن طريق وضع شبكة فوق مصدر الضوء.
يضاف التهوية إلى الثقافات باستخدام مضخات الهواء. استخدم مرشحات بحجم مسام 02 ميكرومتر لتقليل التلوث البكتيري المحمول جوا. يجب تعقيم المواد والمحطات وإعدادها مسبقا.
راجع النص للحصول على التفاصيل. يجب أن يكون للحصى المستخدم في البذر سطح محكم أو محفور قليلا ، حيث من المرجح أن يتم الاحتفاظ بالنباتات المشيجية على ركائز ذات صلابة عالية. افرك وشطف الحصى حتى يصبح الماء صافيا لإزالة أي غبار أو حطام.
انقع الحصى في محلول مبيض مخفف بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة على الأقل ، واشطفه بمياه البحر المعقمة بالمرشح. احسب حجم مياه البحر المعقمة بالترشيح اللازمة لتحديث حاويات الاستزراع كل أسبوع ، وقم بجدولة مهمة الترشيح والتعقيم هذه وفقا لذلك. يمكن تخزين دفعات كبيرة من مياه البحر المعقمة بالترشيح في حاويات مظلمة لمدة تصل إلى ستة أشهر عند ثماني إلى 10 درجات مئوية.
إذا لم يكن التبريد متاحا ، قم بتخزينه في مكان مظلم وبارد. قم بتصفية المياه باستخدام نظام ترشيح فراغي بحجم مسام من 55 إلى ميكرومتر واحد. قم بإيقاف تشغيل مصدر التفريغ قبل سحب كل الماء لتجنب إتلاف الفلتر ، وصب الماء المصفى في وعاء معقم مخصص.
بالنسبة للأحجام الأكبر ، يمكن استخدام نظام ترشيح التدفق. على سبيل المثال ، قم بتشغيل مياه البحر من خلال سلسلة من ثلاثة مرشحات مطوية ، 10 ميكرومتر ، خمسة ميكرومتر ، وميكرومتر واحد ، مرتبة من أكبر إلى أصغر حجم المسام. يتم توصيل نظام التدفق هذا بضوء الأشعة فوق البنفسجية لحوض السمك.
تعقيم مياه البحر المفلترة باستخدام طرق الأشعة فوق البنفسجية و / أو التعقيم. يعد إثراء مياه البحر المعقمة بالترشيح بالمغذيات والفيتامينات أمرا بالغ الأهمية لنمو عشب البحر. تشمل خيارات التخصيب الشائعة وسائط مياه البحر المخصبة بالبروفاسولي ووسائط F / 2.
راجع النص للحصول على التفاصيل. الحصول على التصاريح اللازمة لجمع أنسجة عشب البحر التي تلبي القوانين واللوائح المحلية. عن طريق الغوص ، حدد ثلاث إلى خمس شفرات سبوروفيل من 10 إلى 15 فردا خصبا من Macrocystis pyrifera مع سوري مرئي متباعد من مترين إلى خمسة أمتار.
اختر sporophylls نظيفة وسليمة إن أمكن مع القليل من القاذورات أو التدهور. قم بتخزين شفرات sporophyll بشكل منفصل وفقا للفرد الأبوي من هذه النقطة فصاعدا. تنمو Sporophylls في تنورة كثيفة في القاعدة فوق ثبوت عشب البحر البالغ ، ويمكن التعرف عليها من خلال افتقارها إلى الأكياس الرئوية المملوءة بالغازات.
نقل شفرات sporophyll في أكياس تجميع مظلمة لتجنب التعرض المفرط لأشعة الشمس مملوءة بالحد الأدنى بمياه البحر من الموقع للحفاظ على الشفرات رطبة وتخزينها في مبردات عند حوالي 12 درجة مئوية حتى الوصول إلى مساحة الاستزراع. تأكد من أن العينات ليست على اتصال مباشر مع الجليد. يمكن شحن Sporophylls إلى أو من مواقع أخرى.
شطف sporophylls بمياه البحر المعقمة المفلترة. شفرات التغليف التي تم جمعها من فرد واحد من Macrocystis pyrifera في مناشف ورقية رطبة مبللة بمياه البحر المعقمة المفلترة ، ومرة أخرى في رقائق الألومنيوم لتجنب تغلغل الضوء والجفاف الإضافي. تعرف طريقة التخزين هذه باسم طريقة البوريتو.
ضع هذه العبوات في مبرد به ثلج مع حاجز واقي ، مثل غلاف الفقاعات المعاد تدويره أو الورق المقوى. قم بإعداد المبرد للشحن بين عشية وضحاها وتأكد من وجود شخص ما لاستلام الشحنة ووضع الطرود في ظروف مبردة. اختياريا ، قم بتخزين sporophylls لمدة 12 إلى 48 ساعة في ظروف مبردة ، مما يشجع على إطلاق البوغ من أنسجة سوروس.
للتخزين ، استخدم طريقة البوريتو. إذا تم تخزينها اختياريا ، فابحث عن دليل على وجود أبواغ جزئية على المناشف الورقية تشير إلى وجود أنسجة سوروس خصبة. غالبا ما تكون الأنسجة السوروس مرتفعة قليلا وأغمق في اللون من الأنسجة المحيطة.
حدد أنسجة اللحاء الناضجة ، ومقطعة إلى أقسام مربعة 25 سم باستخدام مقص معقم. اختر قسما أو قسمين نظيفين من 10 إلى 15 من الآباء والأمهات عشب البحر لتعزيز التنوع الجيني. للتنظيف ، افرك جانبي نسيج السوروس برفق في اتجاه واحد فقط باستخدام شاش معقم مبلل بمياه البحر المعقمة بالمرشح.
إذا لزم الأمر ، اكشط أنسجة السوروس برفق باستخدام شفرة حلاقة معقمة. اغمر قسم الصوري في حمام مياه عذبة لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة ، واشطفه بمياه البحر المعقمة بالمرشح. اغمر كل قسم سوري في مياه البحر المعقمة بالترشيح إلى 10 إلى 15 درجة مئوية داخل أنبوب فالكون المعقم سعة 50 ملليلتر.
بدلا من ذلك ، يمكن أن تتكاثر أقسام سوري في حاوية معقمة واحدة. ضع الأنابيب على حرارة أربع إلى 12 درجة مئوية في الظلام لتبويض لمدة أقصاها أربع ساعات. في حالة عدم توفر ثلاجة ، قم بتخزينها في منطقة باردة منخفضة الإضاءة.
باستخدام المجهر المركب ومقياس الدم ، لاحظ كثافة البوغ من ثلاث إلى أربع عينات كل 30 دقيقة حتى أربع ساعات. تغيير أطراف الماصة بين العينات. إذا كانت الكثافة لا تقل عن 10،000 جراثيم لكل ملليلتر ، فانتقل إلى الخطوة التالية.
إذا لم ينتج قسم سوري جراثيم بعد أربع ساعات ، فتخلص من العينة. يمكن أن تستقر الجراثيم في غضون ساعات بعد إطلاقها ، ولكن يمكن ملاحظتها وهي تسبح في حركة دائرية. قم بإزالة كل قسم من أقسام الصوري من أنابيب الصقر الخاصة بهم.
ادمج محاليل البوغ الناتجة في حاوية معقمة واحدة وحدد الكثافة النهائية المجمعة. احسب الحجم النهائي لمحلول البوغ اللازم للتلقيح بتركيز نهائي من 500 إلى 1،000 جرثومة لكل ملليلتر في حاويات الاستزراع. راجع النص للحصول على التفاصيل.
ضع شرائح زجاجية معقمة داخل حاويات الاستزراع لمراقبة تطور عشب البحر. قم بتضمين ما لا يقل عن 30 شريحة موزعة عشوائيا عبر حاويات الثقافة للمراقبة الكافية. قم بتلقيح الحجم المحسوب لمحلول البوغ في حاوية الاستزراع باستخدام طرف ماصة معقم يحتوي على ركائز مغمورة في وسائط النمو.
أغلق الوعاء وحركه برفق لتوزيع الجراثيم. ضع الحاوية في نظام الثقافة الخاص بك. اضبط درجة حرارتك بين 10 إلى 15 درجة مئوية بناء على درجة الحرارة في موقع النشر الخاص بك.
يتم ضبط أضواء الطيف الكامل للنباتات المائية على ضوء لمدة 12 ساعة ودورة مظلمة لمدة 12 ساعة مع شدة ضوء تتراوح بين صفر إلى 180 ميكرومول فوتون لكل متر مربع في الثانية. راجع النص للحصول على مخطط زمني لظروف إضاءة معينة. بعد يوم واحد ، قم بتوفير تهوية خفيفة بمصدر هواء مصفى.
راقب شريحتين زجاجيتين عشوائيتين على الأقل يوميا ، أو كل يومين خلال الأسبوعين الأولين لتقييم التطور. بعد أسبوعين ، راقب ما لا يقل عن شريحتين زجاجيتين عشوائيتين مرة إلى مرتين أسبوعيا للنمو الصحي والتلوث حتى يصل حجم النباتات الجرثومية إلى سنتيمترين إلى سنتيمترين. للمراقبة ، تعامل مع الشريحة بملاقط معقمة وضعها في طبق بتري نظيف يحتوي على ما يكفي من مياه البحر المعقمة لغمر الشريحة الزجاجية.
لا تعيد الشرائح الزجاجية إلى الثقافات بعد إزالتها لتجنب التلوث المتبادل. استخدم مركبا أو مجهرا مقلوبا بتكبير 40 إلى 400x لمراقبة عشب البحر في المرحلة المبكرة. من المتوقع أن يتتبع التطوير الجدول الزمني التالي.
لوحظت جراثيم مستقرة في صفر إلى يوم واحد. يمكن أن تنبت الجراثيم في غضون ساعات قليلة تظهر من خلال تكوين أنبوب جرثومي. عادة ما يتم ملاحظة الإنبات في يوم إلى يومين.
عادة ما يتم ملاحظة النباتات المشيجية المبكرة في يوم إلى أربعة أيام. عادة ما يلاحظ تكوين الأمشاج، وهو العملية التي تخضع من خلالها الخلايا للانقسام والتمايز لتكوين الجاميتات الذكرية والأنثوية، خلال الأسبوعين الأولين. الخلايا الأنثوية أكبر بخمس إلى سبع مرات من الذكور.
تنمو النباتات المشيجية الذكرية فروعا خيطية رقيقة، في حين أن الإناث تكون أكثر استدارة أو بيضاوية الشكل. تنتج الإناث عادة البيض في غضون أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. المنوية المنبعثة من الذكور تخصب البويضات ، والتي تتطور إلى نباتات جرثومية جنينية.
عادة ما يتم ملاحظة الخلايا الصدفية في غضون أسبوعين إلى أربعة أسابيع. يخضع الزيجوت لانقسام سريع للخلايا ، مما يؤدي إلى نمو شفرة سنتيمتر إلى سنتيمترين في غضون ستة إلى ثمانية أسابيع تقريبا. كل أسبوع ، قم بتغيير وسائط النمو لتجديد العناصر الغذائية والمعادن الضرورية لنمو Macrocystis pyrifera.
قم بتبريد وسائط النمو الطازجة إلى درجة الحرارة المناسبة. تأكد من أن وسائط النمو لا تتجاوز 15 درجة مئوية خلال هذه العملية. قم بسحب الوسائط من حاويات الاستزراع الخاصة بك لتجنب إزعاج الركائز المصنفة.
اترك الوسائط تستنزف حتى تصبح الحاوية فارغة تقريبا. قم بتحديث الوسائط على الفور لتقليل الجفاف. قم بإمالة حاويات النمو قليلا عند إعادة التعبئة ، بحيث يمتد الوسائط أسفل جانب حاوية الاستزراع لتقليل إزعاج الركائز إلى الحد الأدنى.
أعد ترتيب مواضع الحاوية أو الحوض بشكل عشوائي أثناء تغييرات الوسائط الأسبوعية لمراعاة الاختلافات في إشعاع الضوء. راجع النص للحصول على تقويم لتتبع الأنشطة والتوقعات لثقافات Macrocystis. يشير إلى توقيت التعديلات على الضوء والتهوية ، وكذلك تغييرات الوسائط الأسبوعية.
بعد ستة إلى ثمانية أسابيع من الاستزراع المختبري ، يبلغ طول النباتات الجرثومية اليافعة من سنتيمتر إلى سنتيمترين وجاهزة للنشر. قم بتحديث وسائط النمو في حاويات الثقافة قبل 24 ساعة من النشر. الحصول على التصاريح اللازمة لنشر الحصى التي تلبي القوانين واللوائح المحلية.
نقل الحصى الأخضر لمدة تصل إلى ست ساعات في مبرد مظلل. يجب توقيت النشر لتجنب أشعة الشمس المباشرة. استخدم هيكلا مظللا على القارب لتجنب أشعة الشمس المباشرة أثناء عملية النشر.
نثر الحصى الأخضر بعناية من السطح على الشعاب المرجانية أدناه ، أو عن طريق الغوص عند التجربة في مواقع جديدة وعلى نطاقات صغيرة. لا تزال تقنية استعادة الحصى الأخضر في المرحلة الأكاديمية مع بيانات بقاء محدودة للأنواع الأخرى ولا توجد بيانات حتى الآن عن Macrocystis pyrifera. ومع ذلك ، فقد لوحظ النجاح في هذا المجال في دراسة تجريبية حديثة ، أشار إليها ارتباط haptera بالركيزة المحيطة وعشب البحر اليافع الذي ينمو حتى 1.2 متر بعد شهرين في الحقل.
باستخدام الجمع الميداني والصيانة المختبرية الموضحة في هذا البروتوكول ، قمنا بزراعة مجموعتين متميزتين من عشب البحر المتبرع عند 12 درجة مئوية و 20 درجة مئوية لتوضيح التأثيرات المعتمدة على درجة الحرارة على تطور المراحل الدقيقة من Macrocystis pyrifera عبر الزمن. بعد 24 يوما ، تم حساب المشيجات من صور المجهر. كان لدرجة الحرارة تأثير على السكان K1 الأكثر برودة ، ولكن ليس على السكان K4 ، مما يشير إلى اختلاف تكيفي محتمل في سمات التسامح الحراري.
هذا يسلط الضوء على أهمية درجات حرارة التربية الخاصة بالموقع. بعد 32 يوما ، تم حساب النباتات البوغية المرئية على كل شريحة زجاجية. كان لدرجة الحرارة تأثير مماثل لكل من السكان K1 و K4.
نمت العينات التي تمت تربيتها عند 20 درجة مئوية عددا قليلا من النباتات البوغية المرئية مقارنة بتلك التي تمت تربيتها عند 12 درجة مئوية. تشير هذه النتيجة إلى أن إنتاج النباتات الجرثومية أكثر حساسية لدرجة الحرارة من مرحلة النبات المشيجي ، وأن درجات حرارة الاستزراع يجب ألا تتجاوز 15 درجة مئوية لتحقيق تطور النبات الجرثومي ، كما هو موضح في البروتوكول. مع هذا البروتوكول المرئي ، نأمل في تشجيع المزيد من التجارب باستخدام طريقة الحصى الأخضر لاستعادة غابات عشب البحر القيمة تحت الماء من قبل الباحثين والمديرين على مستوى العالم.
حظا سعيدا في رحلة الحصى الأخضر مع Macrocystis pyrifera.
