Raccolta sul campo e manutenzione in laboratorio delle alghe giganti che formano la chioma per facilitare il ripristino

Le foreste di alghe stanno affrontando perdite senza precedenti a causa di fattori di stress ambientale causati dal clima e cambiamenti nelle dinamiche trofiche. Questo video illustra un protocollo e strumenti per la coltivazione di alghe giganti, Macrocystis pyrifera, utilizzando la tecnica della ghiaia verde, e fornisce una risorsa preziosa per ulteriori prove per affrontare i successi e i limiti di questo metodo in diversi contesti. Gli impianti di coltivazione delle alghe devono essere in grado di controllare temperature comprese tra 10 e 15 gradi Celsius, fornire una luce a spettro completo compresa tra zero e 180 fotoni micromolecolari per metro quadrato al secondo e un'aerazione filtrata.

I sistemi di incubazione con una presa incorporata o una porta di accesso per fili e tubi possono essere adattati con luci e una fonte d'aria. Se un sistema di incubazione non rientra nell'ambito, nel budget o nella scala prevista del progetto, è possibile utilizzare bagni d'acqua temperati da acqua di mare naturale fredda o da un refrigeratore. Le temperature di allevamento sono specifiche del sito e della stagione.

Posiziona un termometro nel terreno di coltura o usa una pistola termica per assicurarti che la temperatura sia compresa tra 10 e 18 gradi Celsius. Impostare le luci a spettro completo su un periodo di luce di 12 ore, foto al buio di 12 ore utilizzando le impostazioni di temporizzazione sulla sorgente luminosa o collegando la sorgente luminosa a un timer con un ciclo programmabile. Misura l'intensità della luce con un misuratore quantistico PAR sotto la superficie vicino alla ghiaia e regola utilizzando una sorgente luminosa dimmerabile o sovrapponendo una rete alla sorgente luminosa.

L'aerazione viene aggiunta alle colture con l'uso di pompe ad aria. Utilizzare filtri con una dimensione dei pori di 02 micrometri per ridurre la contaminazione batterica nell'aria. I materiali e le stazioni devono essere sterilizzati e preparati in anticipo.

Vedi il testo per i dettagli. La ghiaia utilizzata per la semina dovrebbe avere una superficie strutturata o leggermente bucherellata, poiché è più probabile che i gametofiti vengano trattenuti su substrati con un'elevata rugosità. Strofina e risciacqua la ghiaia fino a quando l'acqua non diventa limpida per rimuovere polvere o detriti.

Immergere la ghiaia in una soluzione di candeggina diluita al 10% per almeno 24 ore e risciacquare con acqua di mare sterilizzata con filtro. Calcola il volume di acqua di mare sterilizzata con filtro necessaria per rinfrescare i contenitori di coltura ogni settimana e pianifica di conseguenza questa attività di filtrazione e sterilizzazione. Grandi lotti di acqua di mare sterilizzata con filtro possono essere conservati in contenitori bui per un massimo di sei mesi a 8-10 gradi Celsius.

Se la refrigerazione non è disponibile, conservare in un luogo buio e fresco. Filtrare l'acqua utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto con una dimensione dei pori da 55 a un micrometro. Spegnere la fonte di vuoto prima che tutta l'acqua venga aspirata per evitare di danneggiare il filtro e versare l'acqua filtrata in un contenitore sterile dedicato.

Per volumi maggiori, è possibile utilizzare un sistema di filtrazione a flusso continuo. Ad esempio, fai scorrere l'acqua di mare attraverso una serie di tre filtri pieghettati, 10 micrometri, cinque micrometri e un micrometro, disposti dalla dimensione dei pori più grande a quella più piccola. Questo sistema a flusso continuo è collegato a una luce UV dell'acquario.

Sterilizzare l'acqua di mare filtrata utilizzando metodi UV e/o sterilizzazione in autoclave. L'arricchimento dell'acqua di mare sterilizzata con filtri con sostanze nutritive e vitamine è fondamentale per la crescita delle alghe. Le opzioni di arricchimento più comuni includono i mezzi di filtrazione con acqua di mare arricchiti con Provasoli e i mezzi F/2.

Vedi il testo per i dettagli. Ottenere i permessi necessari per la raccolta di tessuti di alghe che soddisfino le leggi e i regolamenti locali. Con l'immersione, selezionare da tre a cinque lame di sporofillo da 10 a 15 individui fertili di Macrocystis pyrifera con sori visibili distanziati da due a cinque metri l'uno dall'altro.

Selezionare sporofilli puliti e intatti, se possibile, con poca o nessuna incrostazione o degradazione. Da questo momento in poi, conservare le lame dello sporofillo separatamente in base all'individuo genitore. Gli sporofilli crescono in una gonna densa alla base sopra la tenuta dell'alga adulta e possono essere identificati per la loro mancanza di pneumatocisti piene di gas.

Trasportare le lame degli sporofilli in sacchi di raccolta scuri per evitare la sovraesposizione alla luce solare riempiti in minima parte con acqua di mare dal sito per mantenere le lame bagnate e conservate in refrigeratori a circa 12 gradi Celsius fino all'arrivo nello spazio di coltura. Assicurarsi che i campioni non siano a diretto contatto con il ghiaccio. Gli sporofilli possono essere spediti da o verso altre località.

Sciacquare gli sporofilli con acqua di mare sterilizzata filtrata. Avvolgere le lame raccolte da un singolo individuo di Macrocystis pyrifera in tovaglioli di carta umidi imbevuti di acqua di mare sterilizzata filtrata e di nuovo in un foglio di alluminio per evitare la penetrazione della luce e l'ulteriore essiccazione. Questo metodo di conservazione è comunemente noto come metodo del burrito.

Metti questi pacchetti in una borsa frigo con ghiaccio con una barriera protettiva, come pluriball riciclato o cartone. Preparare il frigorifero per la spedizione notturna e assicurarsi che qualcuno sia disponibile a ricevere la spedizione e posizionare i pacchi in condizioni refrigerate. Facoltativamente, conservare gli sporofilli per 12-48 ore in condizioni refrigerate, che incoraggiano il rilascio di spore dal tessuto sorus.

Per conservare, utilizzare il metodo del burrito. Se conservato opzionalmente, trova segni di sporulazione parziale sui tovaglioli di carta che indicano la presenza di tessuto fertile per il soro. Il tessuto del soro è spesso leggermente sollevato e di colore più scuro rispetto al tessuto circostante.

Seleziona il tessuto maturo e taglialo in sezioni quadrate di 25 centimetri usando forbici sterili. Seleziona una o due sezioni di sori pulite da 10 a 15 singoli genitori di alghe per promuovere la diversità genetica. Per pulire, strofinare delicatamente entrambi i lati del tessuto del soro in una sola direzione con una garza sterile inumidita con acqua di mare sterilizzata con filtro.

Se necessario, raschiare delicatamente il tessuto del soro con una lametta sterile. Immergere la sezione sori in un bagno d'acqua dolce per 30 secondi a un minuto e risciacquare con acqua di mare sterilizzata con filtro. Immergere ogni sezione di sori in acqua di mare sterilizzata con filtro temperata a 10-15 gradi Celsius all'interno di un tubo Falcon sterile da 50 millilitri.

In alternativa, le sezioni sori possono sporulare in un unico contenitore sterile. Posizionare i tubi a una temperatura compresa tra 4 e 12 gradi Celsius al buio per sporulare per un massimo di quattro ore. Se non è disponibile un frigorifero, conservare in un luogo fresco e poco illuminato.

Utilizzando un microscopio composto e un emocitometro, osservare la densità delle spore di tre o quattro campioni ogni 30 minuti fino a quattro ore. Sostituire i puntali delle pipette tra un campione e l'altro. Se le densità sono di almeno 10.000 spore per millilitro, passare al passaggio successivo.

Se una sezione di sori non produce spore dopo quattro ore, scartare il campione. Le spore possono depositarsi entro poche ore dal rilascio, ma possono essere osservate nuotare con un movimento circolare. Rimuovere ciascuna delle sezioni di sori dai loro tubi Falcon.

Combina le soluzioni di spore risultanti in un unico contenitore sterilizzato e quantifica la densità combinata finale. Calcolare il volume finale di soluzione di spore necessario per l'inoculo per una concentrazione finale da 500 a 1.000 spore per millilitro in contenitori di coltura. Vedi il testo per i dettagli.

Posizionare vetrini sterili all'interno di contenitori di coltura per monitorare lo sviluppo di alghe. Includere almeno 30 vetrini distribuiti in modo casuale tra i contenitori di coltura per un monitoraggio sufficiente. Inoculare il volume calcolato di soluzione di spore nel contenitore di coltura utilizzando un puntale per pipetta sterile contenente substrati immersi in terreni di crescita.

Chiudere il contenitore e mescolare delicatamente per distribuire le spore. Posizionare il contenitore nel sistema di coltura. Impostare la temperatura tra 10 e 15 gradi Celsius in base alla temperatura del sito di distribuzione.

Le luci a spettro completo per le piante acquatiche sono impostate su un ciclo di luce di 12 ore, 12 ore di buio con intensità luminose comprese tra zero e 180 micromoli fotoni per metro quadrato. Vedere il testo per una sequenza temporale di condizioni di luce specifiche. Dopo un giorno, fornire una leggera aerazione con una fonte d'aria filtrata.

Monitorare almeno due vetrini casuali al giorno o a giorni alterni per le prime due settimane per valutare lo sviluppo. Dopo due settimane, monitorare almeno due vetrini casuali una o due volte alla settimana per una crescita sana e la contaminazione fino a quando gli sporofiti non raggiungono una dimensione di uno o due centimetri. Per monitorare, maneggiare il vetrino con una pinzetta sterilizzata e metterlo in una capsula di Petri pulita contenente abbastanza acqua di mare sterilizzata per immergere il vetrino.

Non restituire i vetrini alle colture dopo essere stati rimossi per evitare la contaminazione incrociata. Utilizzare un microscopio composto o invertito con un ingrandimento da 40 a 400x per osservare le alghe in fase iniziale. Si prevede che lo sviluppo seguirà la seguente tempistica.

Le spore depositate si osservano da zero a un giorno. Le spore possono germinare in poche ore dimostrate dalla formazione di un tubo germinale. La germinazione si osserva in genere dopo uno o due giorni.

I primi gametofiti si osservano in genere da uno a quattro giorni. La gametogenesi, il processo mediante il quale le cellule subiscono la divisione e la differenziazione per formare gameti maschili e femminili, si osserva in genere entro le prime due settimane. Le cellule femminili sono da cinque a sette volte più grandi di quelle maschili.

I gametofiti maschili sviluppano sottili rami filamentosi, mentre le femmine sono più rotonde o di forma ovoidale. Le femmine in genere producono uova entro due o tre settimane. Lo sperma rilasciato dai maschi feconda le uova, che si sviluppano in sporofiti embrionali.

Gli sporofiti si osservano in genere entro due-quattro settimane. Lo zigote subisce una rapida divisione cellulare, con conseguente crescita di lame da uno a due centimetri entro circa sei-otto settimane. Ogni settimana, cambia i substrati di crescita per reintegrare i nutrienti e i minerali necessari per la crescita di Macrocystis pyrifera.

Raffreddare il substrato di crescita fresco alla temperatura appropriata. Assicurarsi che il terreno di coltura non superi i 15 gradi Celsius durante questo processo. Aspirare i terreni dai contenitori di coltura per evitare il disturbo dei substrati seminati.

Lasciare scolare il terreno fino a quando il contenitore non è quasi vuoto. Aggiornare immediatamente i supporti per ridurre al minimo l'essiccazione. Inclinare leggermente i contenitori di crescita durante il riempimento, in modo che il terreno scorra lungo il lato del contenitore di coltura per disturbare il meno possibile i substrati.

Riorganizzare in modo casuale le posizioni del contenitore o della vasca durante i cambi settimanali dei supporti per tenere conto delle differenze nell'irradiazione della luce. Vedere il testo di un calendario per tenere traccia delle attività e delle aspettative per le colture di Macrocystis. Indica i tempi di regolazione della luce e dell'aerazione, nonché i cambi settimanali dei supporti.

Dopo sei-otto settimane di coltura in laboratorio, gli sporofiti giovani sono lunghi da uno a due centimetri e pronti per la distribuzione. Aggiornare i terreni di crescita nei contenitori di coltura 24 ore prima della distribuzione. Ottenere i permessi necessari per la distribuzione della ghiaia che soddisfino le leggi e i regolamenti locali.

Trasporta la ghiaia verde per un massimo di sei ore in un frigorifero ombreggiato. Il dispiegamento deve essere programmato per evitare la luce solare più diretta. Utilizzare una struttura ombreggiata sull'imbarcazione per evitare il sole diretto durante il processo di dispiegamento.

Spargi con cura la ghiaia verde dalla superficie sulla barriera corallina sottostante o tramite immersioni subacquee quando provi in nuovi siti e su piccola scala. La tecnica di ripristino della ghiaia verde è ancora in fase accademica, con dati limitati sulla sopravvivenza all'espianto per altre specie e nessun dato ancora per Macrocystis pyrifera. Ciononostante, il successo sul campo è stato osservato in un recente studio pilota, indicato dall'attaccamento degli apteri al substrato circostante e dalle giovani alghe che crescono fino a 1,2 metri dopo due mesi sul campo.

Utilizzando la raccolta sul campo e la manutenzione in laboratorio delineata in questo protocollo, abbiamo coltivato due distinte popolazioni di alghe donatrici a 12 gradi Celsius e 20 gradi Celsius per chiarire gli effetti dipendenti dalla temperatura sullo sviluppo di micro-stadi di Macrocystis pyrifera nel tempo. Dopo 24 giorni, i gametofiti sono stati contati dalle immagini del microscopio. La temperatura ha avuto un effetto per la popolazione K1 più fredda, ma non per la popolazione K4, suggerendo una possibile divergenza adattativa nei tratti di tolleranza termica.

Ciò evidenzia l'importanza delle temperature di allevamento specifiche per il sito. Dopo 32 giorni, gli sporofiti visibili sono stati contati su ogni vetrino. La temperatura ha avuto un effetto simile per entrambe le popolazioni K1 e K4.

I campioni allevati a 20 gradi Celsius hanno sviluppato pochi sporofiti visibili rispetto a quelli allevati a 12 gradi Celsius. Questo risultato suggerisce che la produzione di sporofito è più sensibile alla temperatura rispetto allo stadio del gametofito e che le temperature di coltura non devono superare i 15 gradi Celsius per raggiungere lo sviluppo dello sporofito, come delineato nel protocollo. Con questo protocollo visualizzato, speriamo di incoraggiare ulteriori prove con il metodo della ghiaia verde per migliorare il ripristino delle preziose foreste di alghe sottomarine da parte di ricercatori e gestori a livello globale.

In bocca al lupo per il tuo viaggio nella ghiaia verde con Macrocystis pyrifera.