Los bosques de algas marinas se enfrentan a pérdidas sin precedentes debido a los factores de estrés ambiental provocados por el clima y a los cambios en la dinámica trófica. Este video ilustra un protocolo y herramientas para el cultivo de algas gigantes, Macrocystis pyrifera, utilizando la técnica de grava verde, y proporciona un recurso valioso para ensayos posteriores para abordar los éxitos y limitaciones de este método en diferentes entornos. Las instalaciones de cultivo de algas marinas deben ser capaces de controlar temperaturas que oscilan entre 10 y 15 grados centígrados, proporcionar luz de espectro completo que oscile entre cero y 180 fotones micromoles por metro cuadrado por segundo cuadrado y aireación filtrada.
Los sistemas de incubadora con una toma de corriente incorporada o un puerto de acceso para cables y tubos se pueden adaptar con luces y una fuente de aire. Si un sistema de incubadora no está dentro del alcance, el presupuesto o la escala prevista del proyecto, se pueden usar baños de agua templados con agua de mar natural fría o un enfriador. Las temperaturas de cría son específicas del sitio y de la temporada.
Coloque un termómetro en un medio de cultivo o use una pistola de temperatura para asegurarse de que la temperatura esté entre 10 y 18 grados centígrados. Configure las luces de espectro completo en un período de 12 horas de luz y 12 horas de foto oscura utilizando la configuración de tiempo en la fuente de luz o conectando la fuente de luz a un temporizador con un ciclo programable. Mida la intensidad de la luz con un medidor cuántico PAR debajo de la superficie cerca de la grava y ajústela con una fuente de luz regulable o colocando una malla sobre la fuente de luz.
La aireación se añade a los cultivos con el uso de bombas de aire. Utilice filtros con un tamaño de poro de 02 micrómetros para reducir la contaminación bacteriana en el aire. Los materiales y las estaciones deben esterilizarse y prepararse con anticipación.
Consulte el texto para obtener más detalles. La grava utilizada para la siembra debe tener una superficie texturizada o ligeramente picada, ya que es más probable que los gametofitos se retengan en sustratos con una alta rugosidad. Frote y enjuague la grava hasta que el agua salga clara para eliminar el polvo o los escombros.
Remoje la grava en una solución de lejía diluida al 10% durante al menos 24 horas y enjuague con agua de mar esterilizada con filtro. Calcule el volumen de agua de mar esterilizada con filtro necesario para refrescar los recipientes de cultivo cada semana y programe esta tarea de filtración y esterilización en consecuencia. Grandes lotes de agua de mar esterilizada con filtro pueden almacenarse en recipientes oscuros hasta por seis meses a una temperatura de ocho a 10 grados centígrados.
Si no dispone de refrigeración, guárdelo en un lugar oscuro y fresco. Filtre el agua utilizando un sistema de filtración al vacío con un tamaño de poro de 55 a un micrómetro. Apague la fuente de vacío antes de que se extraiga toda el agua para evitar dañar el filtro y vierta el agua filtrada en un recipiente estéril dedicado.
Para volúmenes más grandes, se puede utilizar un sistema de filtración de flujo continuo. Por ejemplo, haga pasar el agua de mar a través de una serie de tres filtros plisados, de 10 micrómetros, cinco micrómetros y un micrómetro, dispuestos de mayor a menor tamaño de poro. Este sistema de flujo continuo está conectado a una luz ultravioleta del acuario.
Esterilice el agua de mar filtrada utilizando métodos UV y/o autoclave. El enriquecimiento del agua de mar esterilizada por filtro con nutrientes y vitaminas es fundamental para el crecimiento de las algas marinas. Las opciones de enriquecimiento comunes incluyen medios de agua de mar enriquecidos con Provasoli y medios F/2.
Consulte el texto para obtener más detalles. Obtenga los permisos necesarios para la recolección de tejido de algas marinas que cumplan con las leyes y regulaciones locales. Por buceo, seleccione de tres a cinco hojas esporófilas de 10 a 15 individuos fértiles de Macrocystis pyrifera con soros visibles espaciados de dos a cinco metros de distancia.
Seleccione esporófilos limpios e intactos si es posible con poca o ninguna suciedad o degradación. A partir de este momento, almacene las hojas de esporófilo por separado según el individuo de origen. Los esporófilos crecen en una falda densa en la base por encima de la sujeción de las algas adultas, y pueden identificarse por su falta de neumatocistos llenos de gas.
Transportar las cuchillas de esporófila en bolsas de recolección oscuras para evitar la sobreexposición a la luz solar, llenas mínimamente de agua de mar del sitio para mantener las cuchillas húmedas y almacenadas en hieleras a aproximadamente 12 grados centígrados hasta su llegada al espacio de cultivo. Asegúrese de que las muestras no estén en contacto directo con el hielo. Los esporófilos se pueden enviar a o desde otros lugares.
Enjuague los esporófilos con agua de mar esterilizada filtrada. Envuelva las cuchillas recolectadas de un solo individuo de Macrocystis pyrifera en toallas de papel húmedas empapadas en agua de mar esterilizada filtrada y nuevamente en papel de aluminio para evitar la penetración de la luz y la desecación adicional. Este método de almacenamiento se conoce comúnmente como el método del burrito.
Coloque estos paquetes en una hielera con hielo con una barrera protectora, como plástico de burbujas reciclado o cartón. Prepare la hielera para el envío nocturno y asegúrese de que haya alguien disponible para recibir el envío y colocar los paquetes en condiciones refrigeradas. Opcionalmente, almacene los esporófilos durante 12 a 48 horas en condiciones refrigeradas, lo que fomenta la liberación de esporas del tejido soro.
Para almacenar, use el método del burrito. Si se almacena opcionalmente, encuentre evidencia de esporulación parcial en las toallas de papel que indiquen la presencia de tejido soro fértil. El tejido del soro suele estar ligeramente elevado y es de color más oscuro que el tejido circundante.
Seleccione tejido de soro maduro y córtelo en secciones cuadradas de 25 centímetros con unas tijeras estériles. Seleccione una o dos secciones de sori limpias de 10 a 15 progenitores individuales de algas marinas para promover la diversidad genética. Para limpiar, frote suavemente ambos lados del tejido del sorus en una sola dirección con una gasa estéril humedecida con agua de mar esterilizada con filtro.
Si es necesario, raspe suavemente el tejido del sorus con una hoja de afeitar estéril. Sumerja la sección sori en un baño de agua dulce durante 30 segundos a un minuto y enjuague con agua de mar esterilizada con filtro. Sumerja cada sección de sori en agua de mar esterilizada con filtro templada a 10 a 15 grados Celsius dentro de un tubo Falcon estéril de 50 mililitros.
Alternativamente, las secciones de sori pueden esporularse en un solo recipiente estéril. Coloque los tubos a una temperatura de cuatro a 12 grados centígrados en la oscuridad para esporular durante un máximo de cuatro horas. Si no hay refrigerador disponible, guárdelo en un lugar fresco y con poca luz.
Usando un microscopio compuesto y un hemocitómetro, observe la densidad de esporas de tres a cuatro muestras cada 30 minutos hasta cuatro horas. Cambie las puntas de pipeta entre muestras. Si las densidades son de al menos 10.000 esporas por mililitro, pasa al siguiente paso.
Si una sección de sori no produce esporas después de cuatro horas, deseche la muestra. Las esporas pueden asentarse a las pocas horas de su liberación, pero se pueden observar nadando en un movimiento circular. Retira cada una de las secciones de sori de sus tubos Falcon.
Combine las soluciones de esporas resultantes en un solo recipiente esterilizado y cuantifique la densidad combinada final. Calcular el volumen final de solución de esporas necesario para la inoculación para una concentración final de 500 a 1.000 esporas por mililitro en recipientes de cultivo. Consulte el texto para obtener más detalles.
Coloque portaobjetos de vidrio estériles dentro de recipientes de cultivo para monitorear el desarrollo de algas marinas. Incluya al menos 30 portaobjetos distribuidos aleatoriamente en contenedores de cultivo para un monitoreo suficiente. Inocular el volumen calculado de solución de esporas en el recipiente de cultivo utilizando una punta de pipeta estéril que contenga sustratos sumergidos en medios de crecimiento.
Cierre el recipiente y revuelva suavemente para distribuir las esporas. Coloque el recipiente en su sistema de cultivo. Establezca su temperatura entre 10 y 15 grados centígrados en función de la temperatura en su sitio de implementación.
Las luces de espectro completo para plantas acuáticas están configuradas en un ciclo de luz de 12 horas y 12 horas de oscuridad con intensidades de luz que oscilan entre cero y 180 micromoles de fotones por metro cuadrado de segundo. Consulte el texto para obtener una línea de tiempo de condiciones de luz específicas. Después de un día, proporcione aireación ligera con una fuente de aire filtrado.
Monitoree al menos dos portaobjetos de vidrio al azar al día, o cada dos días durante las primeras dos semanas para evaluar el desarrollo. Después de dos semanas, controle al menos dos portaobjetos de vidrio al azar una o dos veces por semana para ver si crecen sanos y están contaminados hasta que los esporofitos alcancen un tamaño de uno a dos centímetros. Para monitorear, manipule el portaobjetos con pinzas esterilizadas y colóquelo en una placa de Petri limpia que contenga suficiente agua de mar esterilizada para sumergir el portaobjetos de vidrio.
No devuelva los portaobjetos de vidrio a los cultivos después de retirarlos para evitar la contaminación cruzada. Use un microscopio compuesto o invertido con un aumento de 40 a 400x para observar las algas marinas en etapa temprana. Se espera que el desarrollo siga el siguiente cronograma.
Las esporas sedimentadas se observan de cero a un día. Las esporas pueden germinar en unas pocas horas, lo que se demuestra por la formación de un tubo germinativo. La germinación se observa típicamente a los uno o dos días.
Los gametofitos tempranos se observan típicamente de uno a cuatro días. La gametogénesis, el proceso por el cual las células se dividen y diferencian para formar gametos masculinos y femeninos, generalmente se observa dentro de las primeras dos semanas. Las células femeninas son de cinco a siete veces más grandes que las masculinas.
Los gametofitos masculinos desarrollan ramas filamentosas delgadas, mientras que las hembras son más redondas o de forma ovoide. Las hembras suelen producir huevos en un plazo de dos a tres semanas. Los espermatozoides liberados por los machos fertilizan los óvulos, que se convierten en esporofitos embrionarios.
Los esporofitos suelen observarse en un plazo de dos a cuatro semanas. El cigoto experimenta una rápida división celular, lo que resulta en el crecimiento de láminas de uno a dos centímetros en aproximadamente seis a ocho semanas. Cada semana, cambie los medios de cultivo para reponer los nutrientes y minerales necesarios para el crecimiento de Macrocystis pyrifera.
Enfríe el medio de cultivo fresco a la temperatura adecuada. Asegúrese de que los medios de cultivo no superen los 15 grados centígrados durante este proceso. Sifón los medios de sus recipientes de cultivo para evitar la perturbación de los sustratos sembrados.
Deje que el medio se escurra hasta que el recipiente esté casi vacío. Actualice el medio inmediatamente para minimizar la desecación. Incline ligeramente los recipientes de crecimiento al volver a llenarlos, de modo que los medios corran por el costado del recipiente de cultivo para perturbar mínimamente los sustratos.
Reorganice aleatoriamente las posiciones de los recipientes o de las bañeras durante los cambios semanales de medios para tener en cuenta las diferencias en la irradiación de la luz. Consulte el texto para obtener un calendario para realizar un seguimiento de las actividades y expectativas de los cultivos de Macrocystis. Indica el momento de los ajustes de la luz y la aireación, así como los cambios semanales de medios.
Después de seis a ocho semanas de cultivo en laboratorio, los esporofitos juveniles miden de uno a dos centímetros de largo y están listos para su despliegue. Actualice los medios de cultivo en los contenedores de cultivo 24 horas antes de la implementación. Obtenga los permisos necesarios para el despliegue de grava que cumplan con las leyes y regulaciones locales.
Transporta grava verde hasta por seis horas en una hielera a la sombra. El despliegue debe programarse para evitar la luz solar más directa. Utilice una estructura sombreada en el barco para evitar el sol directo durante el proceso de despliegue.
Esparce con cuidado la grava verde desde la superficie hasta el arrecife de abajo, o a través del buceo cuando pruebes en nuevos sitios y a pequeña escala. La técnica de restauración de grava verde aún se encuentra en fase académica con datos limitados de supervivencia de plantas externas para otras especies y aún no hay datos para Macrocystis pyrifera. No obstante, se ha observado éxito en el campo en un estudio piloto reciente, indicado por la adhesión de los hapteres al sustrato circundante y las algas marinas juveniles que crecen hasta 1,2 metros después de dos meses en el campo.
Utilizando la recolección de campo y el mantenimiento de laboratorio descritos en este protocolo, cultivamos dos poblaciones distintas de algas donantes a 12 grados Celsius y 20 grados Celsius para dilucidar los efectos dependientes de la temperatura en el desarrollo de microestadios de Macrocystis pyrifera a lo largo del tiempo. Después de 24 días, los gametofitos se contaron a partir de imágenes microscópicas. La temperatura tuvo un efecto para la población K1 más fría, pero no para la población K4, lo que sugiere una posible divergencia adaptativa en los rasgos de tolerancia térmica.
Esto pone de relieve la importancia de las temperaturas de cría específicas del lugar. Después de 32 días, se contaron los esporofitos visibles en cada portaobjetos de vidrio. La temperatura tuvo un efecto similar para las poblaciones K1 y K4.
Las muestras criadas a 20 grados centígrados desarrollaron pocos esporofitos visibles en comparación con las criadas a 12 grados centígrados. Este resultado sugiere que la producción de esporofitos es más sensible a la temperatura que la etapa de gametofito, y que las temperaturas de cultivo no deben exceder los 15 grados centígrados para lograr el desarrollo de esporofitos, como se describe en el protocolo. Con este protocolo visualizado, esperamos fomentar más ensayos con el método de grava verde para mejorar la restauración de valiosos bosques de algas marinas submarinas por parte de investigadores y administradores a nivel mundial.
La mejor de las suertes en su viaje de grava verde con Macrocystis pyrifera.
