Леса ламинарии сталкиваются с беспрецедентными потерями из-за экологических стрессовых факторов, вызванных климатом, и сдвигов в трофической динамике. Это видео иллюстрирует протокол и инструменты для культивирования гигантской ламинарии, Macrocystis pyrifera, с использованием метода зеленого гравия, и предоставляет ценный ресурс для дальнейших испытаний, направленных на изучение успехов и ограничений этого метода в различных условиях. Установки для культивирования ламинарии должны иметь возможность контролировать температуру в диапазоне от 10 до 15 градусов по Цельсию, обеспечивать полный спектр света в диапазоне от нуля до 180 микромоль фотонов на метр квадратной секунды и фильтрованную аэрацию.
Системы инкубаторов со встроенным выпускным отверстием или портом доступа для проводов и трубок могут быть оснащены освещением и источником воздуха. Если система инкубатора не входит в рамки проекта, бюджета или предполагаемого масштаба, можно использовать водяные бани, смягченные либо прохладной природной морской водой, либо чиллером. Температура выращивания зависит от места и сезона.
Поместите термометр в питательную среду или используйте температурный пистолет, чтобы убедиться, что температура составляет от 10 до 18 градусов по Цельсию. Установите полный спектр света на 12-часовой световой и 12-часовой темный период фотосъемки, используя настройки времени на источнике света или подключив источник света к таймеру с программируемым циклом. Измерьте интенсивность света с помощью квантового измерителя PAR под поверхностью рядом с гравием и отрегулируйте с помощью источника света с регулируемой яркостью или путем наложения сетки на источник света.
Аэрацию добавляют культурам с применением воздушных насосов. Используйте фильтры с размером пор 02 микрометра, чтобы уменьшить бактериальное загрязнение воздуха. Материалы и станции должны быть стерилизованы и подготовлены заранее.
Подробности см. в тексте. Гравий, используемый для посева, должен иметь текстурированную или слегка ямчатую поверхность, так как гаметофиты с большей вероятностью задерживаются на субстратах с высокой морщинистостью. Потрите и промойте гравий, пока вода не станет прозрачной, чтобы удалить пыль или мусор.
Замочите гравий в 10%-ном растворе хлорной извести не менее чем на 24 часа и смойте фильтрованной морской водой. Рассчитайте объем стерилизованной фильтром морской воды, необходимый для еженедельного обновления контейнеров для культур, и запланируйте эту задачу фильтрации и стерилизации соответствующим образом. Большие партии стерилизованной фильтрованной морской воды можно хранить в темных контейнерах до шести месяцев при температуре от восьми до 10 градусов по Цельсию.
Если холодильник недоступен, храните в темном, прохладном месте. Фильтруют воду с помощью вакуумной системы фильтрации с размером пор от 55 до одного микрометра. Выключите источник вакуума до того, как вся вода будет пропущена, чтобы не повредить фильтр, и перелейте отфильтрованную воду в специальный стерильный контейнер.
Для больших объемов можно использовать проточную систему фильтрации. Например, пропустите морскую воду через серию из трех гофрированных фильтров, 10 микрометров, пяти микрометров и одного микрометра, расположенных от наибольшего до наименьшего размера пор. Эта проточная система подключается к аквариумному ультрафиолетовому свету.
Стерилизовать отфильтрованную морскую воду с помощью УФ-излучения и/или автоклавирования. Обогащение стерилизованной фильтром морской воды питательными веществами и витаминами имеет решающее значение для роста ламинарии. К распространенным вариантам обогащения относятся среда, обогащенная провазоли, и среда F/2.
Подробности см. в тексте. Получить необходимые разрешения на сбор тканей ламинарии, соответствующие местным законам и правилам. С аквалангом выберите от 3 до 5 лопастей спорофилла от 10 до 15 фертильных особей Macrocystis pyrifera с видимыми сори, расположенными на расстоянии от двух до пяти метров друг от друга.
Выбирайте чистые и неповрежденные спорофиллы, если это возможно, с незначительным загрязнением или деградацией или без него. С этого момента храните стебли спорофилла отдельно в зависимости от родительской особи. Спорофиллы растут в плотной юбке у основания над опорой взрослой ламинарии и могут быть идентифицированы по отсутствию у них заполненных газом пневматоцист.
Транспортируйте лопасти спорофилла в темных мешках для сбора, чтобы избежать чрезмерного воздействия солнечного света, минимально заполненных морской водой с участка, чтобы лопасти оставались влажными, и храните в холодильниках при температуре примерно 12 градусов Цельсия до прибытия в место культивирования. Убедитесь, что образцы не находятся в прямом контакте со льдом. Спорофиллы могут быть отправлены в другие места или из других мест.
Спорофиллы промыть фильтрованной стерилизованной морской водой. Оберните лезвия, собранные с одной особи Macrocystis pyrifera, во влажные бумажные полотенца, смоченные в фильтрованной стерилизованной морской воде, а затем снова в алюминиевую фольгу, чтобы избежать проникновения света и дополнительного высыхания. Этот способ хранения широко известен как метод буррито.
Поместите эти пакеты в холодильник со льдом с защитным барьером, например, из переработанной пузырчатой пленки или картона. Подготовьте охладитель к ночной отправке и убедитесь, что кто-то может принять посылку и поместить посылки в холодильные условия. По желанию храните спорофиллы от 12 до 48 часов в холодильнике, что способствует высвобождению спор из тканей соруса.
Для хранения используйте метод буррито. При необходимости храните на бумажных полотенцах следы частичного спороношения, указывающие на наличие фертильной ткани. Ткань соруса часто слегка приподнята и темнее по цвету, чем окружающая ткань.
Отобрать созревшую ткань соруса и нарезать стерильными ножницами на квадратные кусочки по 25 сантиметров. Выберите один-два чистых участка сори от 10 до 15 отдельных родителей ламинарии, чтобы способствовать генетическому разнообразию. Для очистки аккуратно потрите обе стороны ткани соруса только в одном направлении стерильной марлей, смоченной в фильтрованной стерилизованной морской воде.
При необходимости аккуратно соскребите ткань соруса стерильным лезвием бритвы. Погрузите секцию сори в ванну с пресной водой на срок от 30 секунд до одной минуты и промойте фильтрованной морской водой. Погрузите каждую секцию сори в стерилизованную фильтром морскую воду, закаленную до 10-15 градусов Цельсия, в стерильной 50-миллилитровой пробирке Falcon.
В качестве альтернативы сори-секции могут спорулировать в одном стерильном контейнере. Поместите пробирки при температуре от четырех до 12 градусов Цельсия в темноте, чтобы спороношение продолжалось не более четырех часов. Если холодильник недоступен, храните в прохладном месте при слабом освещении.
С помощью составного микроскопа и гемоцитометра наблюдайте за плотностью спор трех-четырех образцов каждые 30 минут до четырех часов. Меняйте наконечники пипеток между образцами. Если плотности составляют не менее 10 000 спор на миллилитр, переходите к следующему этапу.
Если через четыре часа на участке сори спор не образуется, образец выбросьте. Споры могут оседать в течение нескольких часов после выпуска, но можно наблюдать, как они плавают круговыми движениями. Извлеките каждую из секций сори из трубок Falcon.
Смешайте полученные споровые растворы в один стерилизованный контейнер и определите окончательную комбинированную плотность. Рассчитайте окончательный объем спорового раствора, необходимый для посева при конечной концентрации от 500 до 1000 спор на миллилитр в культуральных контейнерах. Подробности см. в тексте.
Поместите стерильные стеклянные предметные стекла в контейнеры с культурами, чтобы следить за развитием ламинарии. Включите не менее 30 слайдов, случайным образом распределенных по контейнерам культур для достаточного мониторинга. Рассчитанный объем спорового раствора высевают в культуральную емкость с помощью стерильного наконечника пипетки, содержащего субстраты, погруженные в питательную среду.
Закройте емкость и аккуратно перемешайте, чтобы распределить споры. Поместите контейнер в культуральную систему. Установите температуру в диапазоне от 10 до 15 градусов Цельсия в зависимости от температуры на месте развертывания.
Полный спектр освещения для водных растений настроен на 12-часовой световой и 12-часовой темный цикл с интенсивностью света в диапазоне от нуля до 180 микромоль фотона на квадратный метр в секунду. Временная шкала конкретных условий освещения приведена в тексте. Через сутки обеспечьте легкую аэрацию с помощью отфильтрованного источника воздуха.
Отслеживайте по крайней мере два случайных предметных стекла ежедневно или через день в течение первых двух недель, чтобы оценить развитие. Через две недели наблюдайте по крайней мере за двумя случайными предметными стеклами один-два раза в неделю на предмет здорового роста и загрязнения, пока спорофиты не достигнут размера от одного до двух сантиметров. Для контроля обработайте предметное стекло стерилизованным пинцетом и поместите его в чистую чашку Петри, содержащую достаточное количество стерилизованной морской воды, чтобы погрузить предметное стекло.
Не возвращайте предметные стекла культуральным культурам во избежание перекрестного загрязнения. Используйте составной или инвертированный микроскоп с увеличением от 40 до 400 раз для наблюдения за ламинариями на ранней стадии. Ожидается, что разработка будет проходить в соответствии со следующими сроками.
Осевшие споры наблюдаются от нуля до одного дня. Споры могут прорастать в течение нескольких часов, о чем свидетельствует образование зародышевой трубки. Всхожесть обычно наблюдается через один-два дня.
Ранние гаметофиты обычно наблюдаются в возрасте от одного до четырех дней. Гаметогенез, процесс, посредством которого клетки подвергаются делению и дифференцировке с образованием мужских и женских гамет, обычно наблюдается в течение первых двух недель. Женские клетки в пять-семь раз крупнее мужских.
Мужские гаметофиты отращивают тонкие нитевидные ветви, в то время как самки имеют более округлую или яйцевидную форму. Самки обычно производят яйца в течение двух-трех недель. Сперматозоиды, высвобождающиеся у самцов, оплодотворяют яйцеклетки, которые развиваются в эмбриональные спорофиты.
Спорофиты обычно наблюдаются в течение двух-четырех недель. Зигота подвергается быстрому делению клеток, в результате чего в течение примерно шести-восьми недель вырастают одно-двухсантиметровые лопасти. Каждую неделю меняйте питательную среду, чтобы восполнить необходимые питательные вещества и минералы для роста Macrocystis pyrifera.
Охладите свежую питательную среду до соответствующей температуры. Следите за тем, чтобы температура питательной среды не превышала 15 градусов Цельсия во время этого процесса. Выкачивайте среду из контейнеров для культивирования, чтобы не повредить засеянные субстраты.
Дайте носителю стечь, пока контейнер не станет почти пустым. Немедленно обновите носитель, чтобы свести к минимуму высыхание. При наполнении слегка наклоняйте контейнеры для выращивания, чтобы среда стекала по стенкам контейнера для культивирования и минимально воздействовала на субстраты.
Случайным образом меняйте положение контейнера или ванны во время еженедельной смены носителя, чтобы учесть различия в освещении. Смотрите текст календаря, чтобы отслеживать активность и ожидания в отношении культур Macrocystis. В нем указываются сроки корректировки света и аэрации, а также еженедельная смена среды.
После шести-восьми недель лабораторного культивирования молодые спорофиты достигают одного-двух сантиметров в длину и готовы к развертыванию. Обновляйте питательные среды в контейнерах культур за 24 часа до развертывания. Получите необходимые разрешения на укладку гравия, соответствующие местным законам и правилам.
Транспортируйте зеленый гравий до шести часов в затененном холодильнике. Развертывание должно быть рассчитано таким образом, чтобы избежать попадания прямых солнечных лучей. Используйте затененную конструкцию на лодке, чтобы избежать попадания прямых солнечных лучей во время развертывания.
Осторожно разбрасывайте зеленый гравий с поверхности на риф внизу или с помощью акваланга при испытаниях на новых участках и в небольших масштабах. Метод восстановления зеленого гравия все еще находится на академической стадии с ограниченными данными о выживаемости наружных растений для других видов и пока нет данных о Macrocystis pyrifera. Тем не менее, в недавнем пилотном исследовании был отмечен успех в полевых условиях, о чем свидетельствует прикрепление гаптеры к окружающему субстрату и молодые ламинарии, вырастающие до 1,2 метра после двух месяцев работы в поле.
Используя полевой сбор и лабораторное обслуживание, описанные в этом протоколе, мы культивировали две различные популяции донорских водорослей при температурах 12 градусов Цельсия и 20 градусов Цельсия, чтобы выяснить температурно-зависимое влияние на развитие микростадий Macrocystis pyrifera с течением времени. Через 24 дня гаметофиты подсчитывали по изображениям под микроскопом. Температура оказывала влияние на более холодную популяцию К1, но не на популяцию К4, что предполагает возможную адаптивную дивергенцию в признаках термопереносимости.
Это подчеркивает важность температуры выращивания в зависимости от места выращивания. Через 32 дня на каждом предметном стекле подсчитывали видимые спорофиты. Температура оказывала одинаковое влияние как для популяций К1, так и для популяций К4.
В образцах, выращенных при температуре 20 градусов по Цельсию, росло мало видимых спорофитов по сравнению с образцами, выращенными при температуре 12 градусов по Цельсию. Этот результат говорит о том, что производство спорофитов более чувствительно к температуре, чем стадия гаметофита, и что температура культивирования не должна превышать 15 градусов Цельсия для достижения развития спорофита, как указано в протоколе. С помощью этого визуализированного протокола мы надеемся стимулировать дальнейшие испытания метода зеленого гравия для масштабного восстановления ценных подводных лесов ламинарии исследователями и менеджерами по всему миру.
Желаем удачи в вашем путешествии по зеленому гравию с Macrocystis pyrifera.
