由于气候驱动的环境压力和营养动态的变化，海带森林正面临前所未有的损失。该视频演示了使用绿色砾石技术培养巨型海带 Macrocystis pyrifera 的方案和工具，并为进一步试验提供了宝贵的资源，以解决该方法在不同环境中的成功和局限性。海带养殖设施必须能够控制10至15摄氏度的温度范围，提供每平方米每秒0至180微摩尔光子的全光谱光，以及过滤曝气。
带有内置插座或电线和管道接入端口的培养箱系统可以与灯和气源配合使用。如果孵化器系统不在项目的范围、预算或预期规模范围内，则可以使用由凉爽的天然海水或冷却器回火的水浴。饲养温度因地制宜。
将温度计放在生长培养基中，或使用温度枪确保温度在 10 到 18 摄氏度之间。使用光源上的定时设置或将光源插入具有可编程周期的计时器，将全光谱灯设置为 12 小时光照、12 小时暗光周期。使用靠近砾石的表面下方的 PAR 量子计测量光强度，并使用可调光光源或通过在光源上分层网格进行调整。
使用气泵将曝气添加到培养物中。使用孔径为 02 微米的过滤器来减少空气中的细菌污染。材料和工位应提前消毒和准备。
有关详细信息，请参阅文本。用于播种的砾石应具有纹理或略带凹痕的表面，因为配子体更有可能保留在具有高粗糙度的基质上。擦洗并冲洗砾石，直到水流清，以去除任何灰尘或碎屑。
将砾石浸泡在 10% 稀释的漂白剂溶液中至少 24 小时，然后用过滤灭菌的海水冲洗。计算每周刷新培养容器所需的过滤灭菌海水量，并相应地安排此过滤和灭菌任务。大批量的过滤灭菌海水可以在8至10摄氏度的黑暗容器中储存长达六个月。
如果没有冷藏，请存放在黑暗、阴凉的地方。使用孔径为 55 至 1 微米的真空过滤系统过滤水。在将所有水拉入之前关闭真空源，以免损坏过滤器，并将过滤后的水倒入专用的无菌容器中。
对于较大的体积，可以使用流通式过滤系统。例如，让海水流过一系列三个褶皱过滤器，10 微米、5 微米和 1 微米，从最大到最小的孔径排列。该流通系统连接到水族箱紫外线灯。
使用紫外线和/或高压灭菌方法对过滤后的海水进行灭菌。用营养物质和维生素丰富过滤灭菌的海水对海带的生长至关重要。常见的富集方案包括富含Provasoli的海水培养基和F/2培养基。
有关详细信息，请参阅文本。获得符合当地法律法规的海带组织采集必要许可。通过水肺潜水，从 10 到 15 个可育的大囊藻个体中选择 3 到 5 个孢子叶，可见的 sori 间隔 2 到 5 米。
如果可能的话，选择干净和完整的孢子叶，几乎没有结垢或降解。从现在开始，根据亲本单独储存孢子叶叶片。孢子叶生长在成年海带固定物上方基部的密集裙边中，可以通过它们缺乏充满气体的气囊来识别。
将孢子叶叶片装在深色收集袋中，以避免过度暴露在阳光下，尽量少地充满来自现场的海水，以保持叶片湿润并储存在大约 12 摄氏度的冷却器中，直到到达培养空间。确保样品不与冰直接接触。孢子叶可以运送到其他地方，也可以从其他地方运出。
用过滤的灭菌海水冲洗孢子叶。将从单个大囊藻个体收集的刀片包裹在浸泡在过滤无菌海水中的湿纸巾中，然后再次包裹在铝箔中，以避免光线穿透和额外的干燥。这种储存方法通常被称为墨西哥卷饼法。
将这些包装放入装有冰块的冷却器中，并带有保护屏障，例如回收的气泡膜或纸板。准备冷藏箱以备隔夜运输，并确保有人可以接收货物并将包裹置于冷藏条件下。或者，将孢子叶在冷藏条件下储存 12 至 48 小时，这会促进孢子从 sorus 组织中释放。
要存储，请使用墨西哥卷饼方法。如果可以选择储存，请在纸巾上找到部分孢子形成的证据，表明存在肥沃的口腔组织。Sorus 组织通常比周围组织略微凸起且颜色更深。
选择成熟的口腔组织，并用无菌剪刀切成 25 厘米见方的切片。从 10 到 15 个单独的海带亲本中选择一到两个干净的 sori 部分，以促进遗传多样性。清洁时，仅用无菌纱布向一个方向轻轻擦洗 sorus 组织的两侧amp用过滤消毒的海水。
如果需要，用无菌剃须刀片轻轻刮擦鼻腔组织。将sori部分浸入淡水浴中30秒至1分钟，然后用过滤消毒的海水冲洗。将每个 sori 部分浸没在无菌 50 毫升 Falcon 管内回火至 10 至 15 摄氏度的过滤灭菌海水中。
或者，sori 切片可以在单个无菌容器中产生孢子。将试管放在 4 至 12 摄氏度的黑暗中，最多产生孢子四个小时。如果没有冰箱，请存放在光线不足、阴凉的地方。
使用复合显微镜和血细胞计数器，每 30 分钟观察 3 到 4 个样品的孢子密度，最多 4 小时。在样品之间更换移液器吸头。如果密度至少为每毫升 10， 000 个孢子，请继续下一步。
如果 sori 切片在 4 小时后不产生孢子，则丢弃样品。孢子可以在释放后数小时内沉降，但可以观察到以圆周运动游动。从他们的 Falcon 管中取出每个 sori 部分。
将所得孢子溶液混合到单个灭菌容器中，并量化最终的组合密度。计算培养容器中接种最终浓度为每毫升 500 至 1， 000 个孢子所需的孢子溶液的最终体积。有关详细信息，请参阅文本。
将无菌载玻片放入培养容器内以监测海带的发育。包括至少 30 张载玻片，这些载玻片随机分布在培养容器中，以便进行充分监测。使用含有浸没在生长培养基中的底物的无菌移液管吸头将计算体积的孢子溶液接种到培养容器中。
关闭容器，轻轻搅拌以分布孢子。将容器放入培养系统中。根据部署站点的温度，将温度设置为 10 到 15 摄氏度之间。
水生植物的全光谱灯设置为 12 小时光照、12 小时暗循环，光强度范围在每平方米平方秒 0 到 180 微摩尔光子之间。有关特定光照条件的时间线，请参阅文本。一天后，用过滤后的气源提供轻度曝气。
每天监测至少两张随机载玻片，或在前两周每隔一天监测一次，以评估发育情况。两周后，每周监测至少两张随机载玻片一到两次，以确保健康生长和污染，直到孢子体达到一到两厘米大小。要进行监测，请用消毒的镊子处理载玻片，并放入干净的培养皿中，培养皿中含有足够的消毒海水以淹没载玻片。
取出后不要将载玻片放回培养物中，以免交叉污染。使用放大倍率为40至400倍的复合显微镜或倒置显微镜观察早期海带。预计开发将遵循以下时间表。
在零到一天观察到沉降的孢子。孢子可以在几个小时内发芽，通过胚管的形成来证明。通常在一到两天内观察到发芽。
早期配子体通常在一到四天观察到。配子发生是细胞经历分裂和分化以形成雄性和雌性配子的过程，通常在前两周内观察到。雌性细胞比雄性大五到七倍。
雄性配子体长出细细的丝状分枝，而雌性则更圆，或卵形。雌性通常在两到三周内产卵。雄性释放的精子使卵子受精，卵子发育成胚胎孢子体。
孢子体通常在两到四周内观察到。受精卵经历快速细胞分裂，在大约六到八周内生长出一到两厘米的叶片。每周更换生长培养基，以补充大囊藻生长所需的营养和矿物质。
将新鲜的生长培养基冷却至适当的温度。在此过程中，确保生长培养基不超过 15 摄氏度。从培养容器中抽出培养基，以避免对接种基质的干扰。
让介质排空，直到容器几乎为空。立即刷新介质以尽量减少干燥。重新填充时稍微倾斜生长容器，使培养基沿着培养容器的侧面流淌，以尽量减少对基质的干扰。
在每周更换培养基期间随机重新排列容器或浴缸位置，以考虑光辐照度的差异。请参阅日历文本，以跟踪大囊藻培养的活动和期望。它指示调整光线和曝气的时间，以及每周的介质变化。
经过六到八周的实验室培养，幼年孢子体长到一到两厘米，可以部署了。在部署前 24 小时刷新培养基中的培养基。获得符合当地法律法规的砾石部署必要许可证。
在阴凉的冷却器中运输绿色砾石长达六个小时。部署时间应避免阳光直射。在部署过程中，利用船上的遮荫结构以避免阳光直射。
小心地将绿色砾石从表面撒到下面的珊瑚礁上，或者在新地点和小规模试验时通过水肺潜水。绿色砾石恢复技术仍处于学术阶段，其他物种的外植存活数据有限，大囊藻的数据尚未公布。尽管如此，在最近的一项试点研究中观察到了该领域的成功，表明在野外两个月后，半翅目附着在周围的基质上，幼年海带长到1.2米。
使用本协议中概述的现场收集和实验室维护，我们在 12 摄氏度和 20 摄氏度下培养了两个不同的供体海带种群，以阐明温度依赖性对 Macrocystis pyrifera 微阶段发展的影响。24天后，从显微镜图像中计数配子体。温度对较冷的 K1 种群有影响，但对 K4 种群没有影响，这表明热耐受性状可能存在适应性差异。
这凸显了特定地点饲养温度的重要性。32天后，在每张载玻片上计数可见的孢子体。温度对 K1 和 K4 种群有类似的影响。
与在12摄氏度下饲养的样品相比，在20摄氏度下饲养的样品生长的可见孢子体很少。这一结果表明，孢子体生产比配子体阶段对温度更敏感，并且培养温度不得超过15摄氏度才能实现孢子体发育，如协议所述。通过这种可视化的方案，我们希望鼓励全球研究人员和管理人员进一步试验绿色砾石方法，以扩大对有价值的水下海带森林的恢复。
祝您在绿色砾石之旅中与Macrocystis pyrifera好运。
