Yosun ormanları, iklim kaynaklı çevresel stres faktörleri ve trofik dinamiklerdeki değişimler nedeniyle benzeri görülmemiş kayıplarla karşı karşıyadır. Bu video, yeşil çakıl tekniğini kullanarak dev yosun Macrocystis pyrifera'yı kültürlemek için bir protokol ve araçları göstermektedir ve bu yöntemin farklı ortamlarda başarılarını ve sınırlamalarını ele almak için daha ileri denemeler için değerli bir kaynak sağlar. Yosun yetiştirme tesisleri, 10 ila 15 santigrat derece arasında değişen sıcaklıkları kontrol edebilmeli, metre kare saniyede sıfır ila 180 mikromol foton arasında değişen tam spektrumlu ışık ve filtrelenmiş havalandırma sağlayabilmelidir.
Dahili bir çıkışa veya teller ve borular için bir erişim portuna sahip inkübatör sistemleri, ışıklar ve bir hava kaynağı ile uyarlanabilir. Bir inkübatör sistemi projenin kapsamı, bütçesi veya amaçlanan ölçeği dahilinde değilse, soğuk doğal deniz suyu veya bir soğutucu ile temperlenmiş su banyoları kullanılabilir. Yetiştirme sıcaklıkları sahaya ve mevsime özgüdür.
Büyüme ortamına bir termometre yerleştirin veya sıcaklığın 10 ila 18 santigrat derece arasında olduğundan emin olmak için bir sıcaklık tabancası kullanın. Işık kaynağındaki zamanlama ayarlarını kullanarak veya ışık kaynağını programlanabilir bir döngüye sahip bir zamanlayıcıya takarak tam spektrumlu ışıkları 12 saatlik ışığa, 12 saatlik karanlık fotoğraf süresine ayarlayın. Çakılın yakınındaki yüzeyin altında bir PAR kuantum metre ile ışık yoğunluğunu ölçün ve kısılabilir bir ışık kaynağı kullanarak veya ışık kaynağının üzerine ağ yerleştirerek ayarlayın.
Hava pompaları kullanılarak kültürlere havalandırma eklenir. Havadaki bakteriyel kontaminasyonu azaltmak için gözenek boyutu 02 mikrometre olan filtreler kullanın. Malzemeler ve istasyonlar önceden sterilize edilmeli ve hazırlanmalıdır.
Ayrıntılar için metne bakın. Tohumlama için kullanılan çakıl, dokulu veya hafif çukurlu bir yüzeye sahip olmalıdır, çünkü gametofitlerin yüksek pürüzlü yüzeylerde tutulması daha olasıdır. Toz veya kalıntıları temizlemek için su berraklaşana kadar çakılları fırçalayın ve durulayın.
Çakılları en az 24 saat boyunca% 10 seyreltilmiş çamaşır suyu çözeltisine batırın ve filtreyle sterilize edilmiş deniz suyuyla durulayın. Kültür kaplarını her hafta yenilemek için gereken filtreyle sterilize edilmiş deniz suyu hacmini hesaplayın ve bu filtreleme ve sterilizasyon görevini buna göre planlayın. Filtreyle sterilize edilmiş büyük partiler halinde deniz suyu, karanlık kaplarda sekiz ila 10 santigrat derecede altı aya kadar saklanabilir.
Soğutma mevcut değilse, karanlık ve serin bir yerde saklayın. Gözenek boyutu 55 ila bir mikrometre olan bir vakum filtreleme sistemi kullanarak suyu filtreleyin. Filtreye zarar vermemek için tüm su çekilmeden önce vakum kaynağını kapatın ve filtrelenmiş suyu özel bir steril kaba dökün.
Daha büyük hacimler için, akışlı bir filtreleme sistemi kullanılabilir. Örneğin, deniz suyunu, en büyükten en küçüğe gözenek boyutuna doğru düzenlenmiş 10 mikrometre, beş mikrometre ve bir mikrometre olmak üzere üç kıvrımlı filtreden geçirin. Bu akış sistemi bir akvaryum UV ışığına bağlıdır.
Filtrelenmiş deniz suyunu UV ve/veya otoklavlama yöntemleri kullanarak sterilize edin. Filtreyle sterilize edilmiş deniz suyunun besinler ve vitaminlerle zenginleştirilmesi, yosun büyümesi için kritik öneme sahiptir. Yaygın zenginleştirme seçenekleri arasında Provasoli ile zenginleştirilmiş deniz suyu ortamı ve F/2 ortamı bulunur.
Ayrıntılar için metne bakın. Yerel yasa ve yönetmeliklere uygun yosun dokusu toplama için gerekli izinleri alın. Tüplü dalış ile, iki ila beş metre aralıklarla görünür sorisi olan 10 ila 15 verimli Macrocystis pyrifera bireyinden üç ila beş sporofil bıçağı seçin.
Mümkünse çok az kirlenme veya bozulma olmadan temiz ve sağlam sporofiller seçin. Bu noktadan itibaren sporofil bıçaklarını ebeveyn bireye göre ayrı ayrı saklayın. Sporofiller, yetişkin yosunun tutucusunun üzerindeki tabanda yoğun bir etekte büyür ve gazla dolu pnömatokistlerin eksikliği ile tanımlanabilir.
Bıçakları ıslak tutmak için sahadan minimum düzeyde deniz suyuyla doldurulmuş güneş ışığına aşırı maruz kalmayı önlemek için sporofil bıçaklarını koyu renkli toplama torbalarında taşıyın ve kültür alanına varana kadar yaklaşık 12 santigrat derecede soğutucularda saklayın. Numunelerin buzla doğrudan temas etmediğinden emin olun. Sporofiller başka yerlere veya başka yerlerden gönderilebilir.
Sporofilleri filtrelenmiş sterilize deniz suyuyla durulayın. Tek bir Macrocystis pyrifera bireyinden toplanan bıçakları, filtrelenmiş sterilize edilmiş deniz suyuna batırılmış nemli kağıt havlulara ve hafif penetrasyonu ve ek kurumayı önlemek için tekrar alüminyum folyoya sarın. Bu depolama yöntemi genellikle börek yöntemi olarak bilinir.
Bu paketleri, geri dönüştürülmüş balonlu naylon veya karton gibi koruyucu bariyerli buzlu bir soğutucuya yerleştirin. Soğutucuyu bir gecede sevkiyat için hazırlayın ve gönderiyi alacak birinin müsait olduğundan emin olun ve paketleri soğutulmuş koşullara yerleştirin. İsteğe bağlı olarak, sporofilleri buzdolabında 12 ila 48 saat saklayın, bu da sporun soru dokusundan salınmasını teşvik eder.
Saklamak için börek yöntemini kullanın. İsteğe bağlı olarak saklanırsa, kağıt havlular üzerinde verimli sorus dokusunun varlığını gösteren kısmi sporülasyon kanıtı bulun. Soru dokusu genellikle çevre dokudan daha hafif kabarık ve daha koyu renklidir.
Olgun doku seçin ve steril makas kullanarak 25 santimetre karelik bölümler halinde kesin. Genetik çeşitliliği teşvik etmek için 10 ila 15 ayrı yosun ebeveyninden bir ila iki temiz sori bölümü seçin. Temizlemek için, soru dokusunun her iki tarafını yalnızca filtreyle sterilize edilmiş deniz suyuyla nemlendirilmiş steril bir gazlı bezle bir yönde nazikçe ovalayın.
Gerekirse, soru dokusunu steril bir jiletle nazikçe kazıyın. Sori bölümünü 30 saniye ila bir dakika boyunca tatlı su banyosuna daldırın ve filtreyle sterilize edilmiş deniz suyuyla durulayın. Her bir sori bölümünü, steril 50 mililitrelik bir Falcon tüpü içinde 10 ila 15 santigrat dereceye kadar temperlenmiş filtreyle sterilize edilmiş deniz suyuna batırın.
Alternatif olarak, sori bölümleri tek bir steril kapta spor yapabilir. Tüpleri en fazla dört saat boyunca spor yapmak için karanlıkta dört ila 12 santigrat dereceye yerleştirin. Buzdolabı yoksa, düşük ışıklı, serin bir yerde saklayın.
Bileşik bir mikroskop ve hemositometre kullanarak, her 30 dakikada bir dört saate kadar üç ila dört numunenin spor yoğunluğunu gözlemleyin. Pipet uçlarını numuneler arasında değiştirin. Yoğunluklar mililitre başına en az 10.000 spor ise, bir sonraki adıma geçin.
Bir sori bölümü dört saat sonra spor üretmezse, numuneyi atın. Sporlar serbest bırakıldıktan sonra saatler içinde yerleşebilir, ancak dairesel bir hareketle yüzerken gözlemlenebilir. Sori bölümlerinin her birini Falcon tüplerinden çıkarın.
Elde edilen spor çözeltilerini tek bir sterilize kapta birleştirin ve nihai birleşik yoğunluğu ölçün. Kültür kaplarında mililitre başına 500 ila 1.000 sporluk bir nihai konsantrasyon için aşılama için gereken son spor çözeltisi hacmini hesaplayın. Ayrıntılar için metne bakın.
Yosun gelişimini izlemek için steril cam slaytları kültür kaplarına yerleştirin. Yeterli izleme için kültür kaplarına rastgele dağıtılmış en az 30 slayt ekleyin. Hesaplanan spor çözeltisi hacmini, büyüme ortamına batırılmış substratlar içeren steril bir pipet ucu kullanarak kültür kabına aşılayın.
Kabı kapatın ve sporları dağıtmak için hafifçe karıştırın. Kabı kültür sisteminize yerleştirin. Dağıtım sahanızdaki sıcaklığa bağlı olarak sıcaklığınızı 10 ila 15 santigrat derece arasında ayarlayın.
Su bitkileri için tam spektrumlu ışıklar, saniyede metre kare başına sıfır ila 180 mikromol foton arasında değişen ışık yoğunlukları ile 12 saatlik ışık, 12 saatlik karanlık döngüye ayarlanmıştır. Belirli ışık koşullarının zaman çizelgesi için metne bakın. Bir gün sonra, filtrelenmiş bir hava kaynağı ile hafif havalandırma sağlayın.
Gelişimi değerlendirmek için günde en az iki rastgele cam slaytı veya ilk iki hafta boyunca her gün izleyin. İki hafta sonra, sporofitler bir ila iki santimetre boyuta ulaşana kadar sağlıklı büyüme ve kontaminasyon için haftada bir ila iki kez en az iki rastgele cam slaytı izleyin. İzlemek için, slaydı sterilize edilmiş cımbızla tutun ve cam slaytı daldırmaya yetecek kadar sterilize edilmiş deniz suyu içeren temiz bir Petri kabına koyun.
Çapraz kontaminasyonu önlemek için cam slaytları çıkarıldıktan sonra kültürlere geri koymayın. Erken evre yosunları gözlemlemek için 40 ila 400x büyütmede bir bileşik veya ters mikroskop kullanın. Geliştirmenin aşağıdaki zaman çizelgesini izlemesi bekleniyor.
Yerleşik sporlar sıfır ila bir günde gözlenir. Sporlar, bir germ tüpünün oluşumu ile gösterilen birkaç saat içinde filizlenebilir. Çimlenme tipik olarak bir ila iki günde gözlenir.
Erken gametofitler tipik olarak bir ila dört gün arasında gözlenir. Hücrelerin erkek ve dişi gametler oluşturmak için bölünme ve farklılaşma geçirdiği süreç olan gametogenez, tipik olarak ilk iki hafta içinde gözlenir. Dişi hücreler erkeklerden beş ila yedi kat daha büyüktür.
Erkek gametofitler ince ipliksi dallar yetiştirirken, dişiler daha yuvarlak veya oval şekillidir. Dişiler tipik olarak iki ila üç hafta içinde yumurta üretirler. Erkeklerden salınan sperm, embriyonik sporofitlere dönüşen yumurtaları döller.
Sporofitler tipik olarak iki ila dört hafta içinde gözlenir. Zigot hızlı hücre bölünmesine uğrar ve yaklaşık altı ila sekiz hafta içinde bir ila iki santimetre bıçağın büyümesine neden olur. Her hafta, Macrocystis pyrifera büyümesi için gerekli besinleri ve mineralleri yenilemek için büyüme ortamını değiştirin.
Taze büyüme ortamını uygun sıcaklığa soğutun. Bu işlem sırasında büyüme ortamının 15 santigrat dereceyi geçmediğinden emin olun. Tohumlanmış substratların bozulmasını önlemek için ortamı kültür kaplarınızdan sifonlayın.
Kap neredeyse boşalana kadar ortamın boşalmasına izin verin. Kurumayı en aza indirmek için ortamı hemen yenileyin. Yeniden doldururken büyüme kaplarını hafifçe eğin, böylece ortam, alt tabakaları minimum düzeyde rahatsız etmek için kültür kabının yanından aşağı akar.
Işık ışınımındaki farklılıkları hesaba katmak için haftalık ortam değişiklikleri sırasında kap veya küvet konumlarını rastgele yeniden düzenleyin. Macrocystis kültürleri için etkinlikleri ve beklentileri izlemek için bir takvim metnine bakın. Işık ve havalandırma ayarlarının zamanlamasını ve haftalık ortam değişikliklerini gösterir.
Altı ila sekiz haftalık laboratuvar kültüründen sonra, juvenil sporofitler bir ila iki santimetre uzunluğundadır ve konuşlandırmaya hazırdır. Dağıtımdan 24 saat önce kültür kapsayıcılarındaki büyüme medyasını yenileyin. Yerel yasa ve yönetmeliklere uygun çakıl dağıtımı için gerekli izinleri alın.
Yeşil çakılları gölgeli bir soğutucuda altı saate kadar taşıyın. Dağıtım, en doğrudan güneş ışığından kaçınmak için zamanlanmalıdır. Konuşlandırma işlemi sırasında doğrudan güneşten kaçınmak için teknede gölgeli bir yapı kullanın.
Yüzeydeki yeşil çakılları aşağıdaki resife veya yeni alanlarda ve küçük ölçeklerde deneme yaparken tüplü olarak dikkatlice dağıtın. Yeşil çakıl restorasyon tekniği, diğer türler için sınırlı bitki sağkalım verileri ve Macrocystis pyrifera için henüz veri bulunmadığı için hala akademik aşamadadır. Bununla birlikte, yakın zamanda yapılan bir pilot çalışmada, çevredeki alt tabakaya haptera bağlanması ve tarlada iki ay sonra 1,2 metreye kadar büyüyen genç yosunlar ile gösterilen bir pilot çalışmada bu alanda başarı gözlemlenmiştir.
Bu protokolde özetlenen saha toplama ve laboratuvar bakımını kullanarak, zaman içinde Macrocystis pyrifera'nın mikro aşamalarının gelişimi üzerindeki sıcaklığa bağlı etkileri aydınlatmak için 12 santigrat derece ve 20 santigrat derecede iki farklı donör yosun popülasyonunu kültürledik. 24 gün sonra, mikroskop görüntülerinden gametofitler sayıldı. Sıcaklığın daha soğuk K1 popülasyonu için bir etkisi vardı, ancak K4 popülasyonu için değil, termal tolerans özelliklerinde olası bir adaptif sapma olduğunu düşündürdü.
Bu, sahaya özgü yetiştirme sıcaklıklarının önemini vurgulamaktadır. 32 gün sonra, her cam slaytta görünür sporofitler sayıldı. Sıcaklık, hem K1 hem de K4 popülasyonları için benzer bir etkiye sahipti.
20 santigrat derecede yetiştirilen örnekler, 12 santigrat derecede yetiştirilenlere kıyasla daha az görünür sporofit yetiştirdi. Bu sonuç, sporofit üretiminin gametofit aşamasından daha sıcaklığa daha duyarlı olduğunu ve protokolde belirtildiği gibi sporofit gelişimini sağlamak için kültür sıcaklıklarının 15 santigrat dereceyi geçmemesi gerektiğini göstermektedir. Bu görselleştirilmiş protokolle, küresel olarak araştırmacılar ve yöneticiler tarafından değerli sualtı yosun ormanlarının restorasyonunu yükseltmek için yeşil çakıl yöntemiyle daha fazla denemeyi teşvik etmeyi umuyoruz.
Macrocystis pyrifera ile yeşil çakıl yolculuğunuzda iyi şanslar.
