昆布の森は、気候による環境ストレス要因と栄養動態の変化により、前例のない損失に直面しています。このビデオでは、グリーングラベル技術を使用してジャイアントケルプ(Macrocystis pyrifera)を培養するためのプロトコルとツールを紹介し、さまざまな環境でこの方法の成功と限界に対処するためのさらなる試験のための貴重なリソースを提供します。昆布の養殖施設は、摂氏10度から15度の範囲の温度を制御し、毎秒0〜180マイクロモルの光子の範囲のフルスペクトル光を提供し、フィルター付き曝気を行える必要があります。
コンセントが内蔵されているインキュベーターシステム、またはワイヤーやチューブ用のアクセスポートは、ライトと空気源で調整できます。インキュベーターシステムがプロジェクトの範囲、予算、または意図した規模に収まらない場合は、冷たい天然海水またはチラーで焼き戻したウォーターバスを使用できます。飼育温度は場所や季節によって異なります。
増殖培地に温度計を置くか、温度ガンを使用して、温度が摂氏10〜18度であることを確認します。光源のタイミング設定を使用するか、プログラム可能なサイクルで光源をタイマーに接続することにより、フルスペクトルライトを12時間のライト、12時間の暗い写真期間に設定します。砂利の近くの表面下にあるPAR量子メーターで光強度を測定し、調光可能な光源を使用するか、光源の上にメッシュを重ねて調整します。
曝気は、エアポンプを使用して培養物に追加されます。空気中の細菌汚染を減らすために、孔径02マイクロメートルのフィルターを使用してください。材料とステーションは、事前に滅菌して準備する必要があります。
詳細については、テキストを参照してください。播種に使用される砂利は、配偶体が高粘度で基質に保持される可能性が高いため、テクスチャードのある、またはわずかに穴のある表面を持つ必要があります。水が透明になるまで砂利をこすり洗いしてすすぎ、ほこりや破片を取り除きます。
砂利を10%希釈した漂白剤溶液に24時間以上浸し、ろ過滅菌した海水ですすいでください。培養容器のリフレッシュに必要なろ過滅菌海水の量を毎週計算し、それに応じてこのろ過および滅菌タスクをスケジュールします。ろ過滅菌された大量の海水は、摂氏8〜10度で最大6か月間暗い容器に保管できます。
冷蔵できない場合は、暗くて涼しい場所に保管してください。孔径55〜1マイクロメートルの真空ろ過システムを使用して水をろ過します。フィルターの損傷を防ぐために、すべての水が引き込まれる前に真空源をオフにし、ろ過された水を専用の滅菌容器に注ぎます。
大容量の場合は、フロースルーろ過システムを使用できます。たとえば、10マイクロメートル、5マイクロメートル、1マイクロメートルの3つのプリーツフィルターに海水を通し、孔径の大きいものから小さいものへと配置します。このフロースルーシステムは、水槽のUVライトに接続されています。
ろ過された海水は、UV法やオートクレーブ法で滅菌します。濾過滅菌した海水に栄養素やビタミンを豊富に含ませることは、昆布の成長に不可欠です。一般的な濃縮オプションには、プロバソリ濃縮海水培地とF/2培地があります。
詳細については、テキストを参照してください。現地の法律や規制を満たす昆布組織の収集に必要な許可を取得します。スキューバダイビングでは、2〜5メートルの間隔で目に見えるソリを持つ10〜15個の肥沃なMacrocystis pyrifera個体から3〜5枚の胞子葉を選択します。
可能であれば、汚れや劣化がほとんどまたはまったくない、清潔で無傷の胞子葉を選択してください。胞子葉の刃は、この時点から親個体に応じて別々に保管してください。胞子葉は、成体の昆布のホールドファストの上の基部に密集したスカートで成長し、ガスで満たされた肺嚢胞がないことで識別できます。
胞子葉の刃は、日光に過度にさらされないよう暗い収集袋に入れて輸送し、現場からの海水を最小限に抑えて湿った状態に保ち、培養スペースに到着するまで約12°Cのクーラーで保管します。サンプルが氷と直接接触していないことを確認してください。胞子葉は、他の場所に出荷することも、他の場所から出荷することもできます。
ろ過滅菌した海水で胞子葉をすすぎます。1匹のMacrocystis pyrifera個体から採取したブレードを、ろ過滅菌した海水に浸した湿らせたペーパータオルで包み、再びアルミホイルで包み、光の侵入や追加の乾燥を防ぎます。この保存方法は、一般にブリトー法として知られています。
これらのパッケージは、リサイクルされた気泡緩衝材や段ボールなどの保護バリア付きの氷を入れたクーラーボックスに入れます。クーラーボックスを翌日発送の準備をし、誰かが荷物を受け取り、パッケージを冷蔵状態に置いてくれることを確認してください。必要に応じて、胞子葉を冷蔵状態で12〜48時間保存すると、胞子組織からの胞子の放出が促進されます。
保存するには、ブリトー法を使用します。オプションで保管する場合は、ペーパータオルに部分胞子形成の証拠を見つけて、肥沃な卵婆組織の存在を示します。ソラス組織は、周囲の組織よりもわずかに隆起し、色が濃いことがよくあります。
熟した石部組織を選択し、滅菌ハサミを使用して25センチメートル四方のセクションにカットします。遺伝的多様性を促進するために、10〜15匹の昆布の親から1〜2つのきれいなソリセクションを選択します。洗浄するには、フィルター滅菌した海水で湿らせた滅菌ガーゼを使用して、皮膚組織の両側を一方向にのみ静かにこすります。
必要に応じて、滅菌カミソリの刃で石部組織をそっとこすります。ソリ切片を淡水浴に30秒〜1分間浸し、ろ過殺菌した海水ですすいでください。滅菌済みの50ミリリットルのファルコンチューブ内で、摂氏10〜15度に焼き戻したフィルター滅菌海水に各ソリセクションを浸します。
あるいは、ソリ切片は単一の滅菌容器内で胞子を形成することができます。チューブを摂氏4〜12度で暗闇に置き、最大4時間胞子を形成します。冷蔵庫がない場合は、暗い涼しい場所に保管してください。
複合顕微鏡と血球計算盤を使用して、30分ごとに最大4時間ごとに3〜4サンプルの胞子密度を観察します。サンプル間でピペットチップを交換します。密度がミリリットルあたり少なくとも10, 000胞子の場合は、次のステップに進みます。
4時間後に胞子が産生されない場合は、サンプルを廃棄します。胞子は放出後数時間以内に沈殿することがありますが、円を描くように泳いでいるのが観察されることがあります。ファルコンチューブから各ソリセクションを取り外します。
得られた胞子溶液を単一の滅菌容器に混ぜ合わせ、最終的な合計密度を定量化します。培養容器内の1ミリリットルあたり500〜1, 000胞子の最終濃度の接種に必要な胞子溶液の最終量を計算します。詳細については、テキストを参照してください。
培養容器内に滅菌スライドガラスを入れて、昆布の発育を観察します。十分なモニタリングのために、培養容器にランダムに分散した少なくとも30枚のスライドを含めます。計算された量の胞子溶液を、増殖培地に浸した基質を含む滅菌ピペットチップを使用して培養容器に接種します。
容器を閉じ、静かにかき混ぜて胞子を分散させます。容器を培養システムに入れます。展開サイトの温度に基づいて、温度を摂氏 10 度から 15 度の間で設定します。
水生植物用のフルスペクトルライトは、12時間の光、12時間の暗サイクルに設定され、光強度は1平方メートル毎秒0〜180マイクロモルの光子の範囲です。特定の光の状態のタイムラインについては、テキストを参照してください。1日後、ろ過された空気源で軽い曝気を行います。
最初の2週間は、毎日少なくとも2枚、または1日おきにスライドガラスをランダムにモニターして、発達を評価します。2週間後、胞子体のサイズが1〜2センチメートルに達するまで、少なくとも2つのランダムなスライドガラスを週に1〜2回監視して、健全な成長と汚染を確認します。モニターするには、滅菌ピンセットでスライドを取り扱い、スライドガラスを沈めるのに十分な滅菌海水を含む清潔なペトリ皿に入れます。
クロスコンタミネーションを避けるため、スライドガラスを除去した後は培養物に戻さないでください。複合顕微鏡、または倍率40〜400倍の倒立顕微鏡を使用して、初期段階の昆布を観察します。開発は、次のタイムラインをたどることが期待されています。
沈降した胞子は0〜1日で観察されます。胞子は、生殖管の形成によって実証され、数時間以内に発芽する可能性があります。発芽は通常、1〜2日で観察されます。
初期の配偶体は通常、1〜4日で観察されます。配偶子形成は、細胞が分裂と分化を経て雄と雌の配偶子を形成するプロセスであり、通常、最初の2週間以内に観察されます。女性の細胞は男性の5〜7倍の大きさです。
雄の配偶体は細い糸状の枝を成長させますが、雌はより丸い、または卵形です。雌は通常、2〜3週間以内に卵を産みます。オスから放出された精子は卵子を受精させ、卵子は胚胞子体に発達します。
胞子体は通常、2〜4週間以内に観察されます。受精卵は急速に細胞分裂し、約6〜8週間以内に1〜2センチメートルのブレードが成長します。毎週、成長培地を交換して、Macrocystis pyriferaの成長に必要な栄養素とミネラルを補充します。
新鮮な培地を適切な温度に冷却します。このプロセス中、増殖培地が摂氏15度を超えないようにしてください。培養容器から培地を吸い上げて、播種された基質の乱れを防ぎます。
容器がほぼ空になるまで培地を排出します。乾燥を最小限に抑えるために、メディアをすぐに更新します。補充するときは、培地が培養容器の側面を流れ落ち、基質の乱れを最小限に抑えるように、増殖容器を少し傾けてください。
毎週の培地交換時に容器や槽の位置をランダムに再配置し、光の放射照度の違いを考慮します。Macrocystis培養の活動と期待を追跡するためのカレンダーのテキストを参照してください。これは、光と曝気の調整のタイミング、および毎週のメディアの変更を示します。
6〜8週間の実験室培養の後、幼魚の胞子体は長さ1〜2センチメートルになり、展開の準備が整います。導入の24時間前に培養容器内の増殖培地をリフレッシュします。現地の法律や規制を満たす砂利の展開に必要な許可を取得します。
緑の砂利を日陰のクーラーで最大6時間輸送します。展開は、直射日光が最も避けるようにタイミングを合わせる必要があります。展開プロセス中に直射日光を避けるために、ボートの日陰構造を利用してください。
地表から下のサンゴ礁に緑の砂利を慎重に散布するか、新しい場所や小規模で試す場合はスキューバダイビングで散布します。緑色の砂利の復元技術はまだ学術段階にあり、他の種の外植生の生存データは限られており、Macrocystis pyriferaのデータはまだありません。それにもかかわらず、最近のパイロット研究では、現場での成功が観察されており、周囲の基質へのハプテラ付着と、野外での2か月後には1.2メートルまで成長する稚ケルプが示されています。
このプロトコールで概説されている野外採集と実験室でのメンテナンスを使用して、摂氏12度と摂氏20度の2つの異なるドナーケルプ集団を培養し、Macrocystis pyriferaのミクロ段階の発達に対する温度依存的な影響を経時的に解明しました。24日後、顕微鏡画像から配偶体を数えた。気温は低温のK1集団には影響を与えたが、K4集団には影響しなかったことから、熱耐性形質の適応的分岐の可能性が示唆された。
これは、サイト固有の飼育温度の重要性を浮き彫りにしています。32日後、目に見える胞子体を各スライドガラスでカウントしました。温度は、K1集団とK4集団の両方に同様の効果をもたらしました。
摂氏20度で飼育されたサンプルは、摂氏12度で飼育されたサンプルと比較して、目に見える胞子体がほとんど成長しませんでした。この結果は、胞子体産生は配偶体期よりも温度に敏感であり、プロトコルで概説されているように、胞子体の発生を達成するためには培養温度が摂氏15度を超えてはならないことを示唆しています。この可視化されたプロトコルにより、世界中の研究者や管理者による貴重な海底昆布林の再生を拡大するために、グリーングラベル法によるさらなる試験を奨励したいと考えています。
Macrocystis pyriferaとの緑の砂利の旅で幸運を祈ります。
