المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82101249 إلى XY Sun) ، مؤسسة أبحاث ما بعد الدكتوراه في الصين (منحة رقم 2022M722125 إلى XY Sun). برنامج شنغهاي للإبحار (منحة رقم 21YF1425100 إلى SH Chen). المشروع الخاص للبحوث السريرية التابع للجنة الصحة البلدية في شنغهاي (المنحة رقم 202340088 إلى J Zhou). المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82101262 ل X Zhang ، المنحة رقم 82101287 إلى SH Chen).

أجريت جميع التجارب على وفقا لإرشادات الإبلاغ عن البحوث الحيوانية في التجارب الحية (ARRIVE) ودليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على الدراسة الحالية من قبل لجنة رعاية واستخدام في مستشفى رينجي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياوتونغ. تم استخدام الفئران الذكور C57BL / 6J البالغة من العمر ثمانية أسابيع في الدراسة الحالية. تم الحصول على تجاريا (انظر جدول المواد) وتم وضعها في أقفاص قياسية (22 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية ، 12 ساعة / 12 ساعة دورة الضوء / الظلام ، الطعام ، والماء حسب الرغبة).
1. اختيار مناطق الدماغ المستهدفة
ملاحظة: هذا إجراء معقم. تأكد من تعقيم جميع الأدوات الجراحية. رش القفازات بالكحول قبل ملامسة الأدوات الجراحية. تجنب لمس طرف الأدوات أو المنطقة الجراحية بالقفازات. تأكد من تخدير الفأر بشكل كاف قبل بدء الإجراء عن طريق التحقق من فقدان ردود الفعل الصحيحة وعدم الاستجابة للتحفيز الجلدي. قبل الحفر والحقن ، راقب عن كثب معدل التنفس (60-220 نفسا في الدقيقة ، بمتوسط 100-150 نفسا في الدقيقة) وسعة التنفس (يجب أن تكون متسقة وليست ضحلة أو عميقة بشكل مفرط). يجب ملاحظة أي تغييرات كبيرة في معدل التنفس أو السعة.
<ol><li>تخدير الفأر بحقن داخل الصفاق بنسبة 1.25٪ ثلاثي برومو إيثانول (250 ملغم / كغم) باستخدام إبرة 29 غرام. حلق الشعر على الجمجمة بمجرد اختفاء رد الفعل الصحيح. قم بتأمين الماوس في الإطار التجسيمي (انظر جدول المواد) عن طريق تثبيت القواطع العلوية بمشبك أنف وتثبيت الرأس باستخدام قضيبين للأذن.</li>
	<li>تطبيق مرهم العيون لمنع جفاف العين. تطهير فروة الرأس عن طريق مسحها ثلاث مرات مع Anerdian (محلول مطهر ؛ انظر جدول المواد). حقن 0.2 مل من 1٪ ليدوكائين تحت الجلد باستخدام إبرة الأنسولين 29 غرام لتوفير تسكين موضعي.</li>
	<li>قم بعمل شق 0.5 سم باستخدام مقص العين لكشف الجمجمة. استخدم قطعة قطن مغموسة بنسبة 3٪ H2O2 لفرك الجمجمة المكشوفة لإزالة السمحاق. اترك الجمجمة حتى تجف.</li>
	<li>لصق الحفر على أداة stereotaxic. اضبط مقابض الأذرع المجسمة لوضع طرف الحفر بدقة في bregma بمساعدة المكبر وتسجيل قيمة المحور z باستخدام شاشة LCD الرقمية.<ol><li>اضبط المقابض وضع طرف الحفر في لامدا وسجل قيمة المحور z. اضبط مشبك الأنف وقضبان الأذن لتقريب قيمتي z ، وكرر الخطوات أعلاه حتى يصبح الفرق بين قيمتي z أقل من 0.1 مم. ملاحظة: تتوافق المحاور x و y و z على شاشة LCD الرقمية مع المحاور المتوسطة (ML) والأمامية الخلفية (AP) والظهرية البطنية (DV) على التوالي. يمكن اعتبار bregma و lambda على نفس المستوى الأفقي بمجرد أن يكون الفرق بين قيمتي z أقل من 0.1 مم.</li>
	</ol></li>
	<li>ضمان مستوى اليسار واليمين من الدماغ. اضبط قضبان الأذن المرفقة بالإطار التجسيمي بنفس المقياس. خذ النواة الرباعية اللاحقة ، الجزء البطني (LDTgV) ، على سبيل المثال ؛ إحداثياتها المجسمة هي -5.2 ل x ، +0.8 ل y ، -4.0 ل z ، وفقا ل Paxinos و Franklin's Mouse BrainAtlas 16.<ol><li>اضبط شريط الأذن لعمل المثقاب عند (-5.2 ، +0.8) لقياس قيمة z في الاتجاه الظهري البطني وحرك المثقاب إلى (-5.2 ، -0.8) لقياس قيمة z. ملاحظة: يعتبر اليسار-اليمين عند المستوى المتساوي عندما يكون الفرق بين قيمتي z أقل من 0.2 مم. يجب إدخال قضبان الأذن في المكان المناسب لأن الصماخ السمعي الخارجي متماثل. إذا كان الفرق بين قيمتي z أكثر من 0.5 مم ، فقد يتم إدخال شريط الأذن في المكان الخطأ.</li>
	</ol></li>
	<li>ضع المثقاب على bregma مرة أخرى واضبط ثلاثة إحداثيات على شاشة LCD الرقمية على الصفر. ضع التمرين فوق منطقة الاهتمام باستخدام الإحداثيات المرجعية. ابدأ التدريبات.<ol><li>خفض تدريجيا الحفر باستخدام الذراع العمودي حتى يخترق الجمجمة. قم بإزالة الحطام والدم باستخدام مسحات القطن. ملاحظة: احرص على عدم إتلاف أنسجة المخ.</li>
	</ol></li>
</ol>2. تحضير محلول الصبغة والحقن المجهري للدماغ
<ol><li>خذ 25 ميكرولتر من مخزن التحميل SDS-PAGE الذي يحتوي على بروموفينول أزرق (انظر جدول المواد) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 200 ميكرولتر. أضف 50 ميكرولتر من ddH2O إلى الأنبوب لتحضير محلول الصبغة.</li>
	<li>قم بتغطية نافذة الجمجمة بقطعة قطن مبللة بالمحلول الملحي. تأكد من سالكية الحقن الدقيقة عن طريق شفط وطرد المحلول الملحي بشكل متكرر. قم بتحميل 0.3 ميكرولتر من الصبغة في المحقنة الدقيقة. قم بتوصيل المحقنة والحاقن الدقيق التجسيمي الميكانيكي بالذراع المجسم.</li>
	<li>ضع طرف المحقنة في bregma واضبط الإحداثيات على الصفر على شاشة LCD الرقمية. اضبط الإبرة في منطقة الاهتمام وفقا للإحداثيات المرجعية. اضبط سرعة الحقن على 0.1 ميكرولتر / دقيقة وابدأ الحاقن الدقيق الميكانيكي ، مما يوفر 0.3 ميكرولتر من الصبغة الزرقاء في المنطقة المستهدفة. اترك المحقنة في موضعها لمدة 10 دقائق على الأقل قبل سحب الحاقن ببطء. ملاحظة: يمكن استخدام أصباغ ملونة مختلفة في نفس الفئران لتمييز المناطق القريبة. اختبر الأصباغ الأخرى بحثا عن تركيزات مناسبة بناء على خصائصها الفيزيائية. يوصى باستخدام تركيبة البروموفينول الأزرق وشطف المحقنة جيدا قبل الاستخدام وبعده لمنع الانسداد. اضبط أحجام الحقن بناء على انتشار الصبغة.</li>
</ol>3. حصاد أنسجة المخ والتشريح بالتبريد
<ol><li>حرر الماوس من الإطار المجسم. تخدير الفأر بحقن داخل الصفاق من 50 ملغم / كغم من الصوديوم بنتوباربيتال باستخدام إبرة 29 غرام. تأمين الماوس على لوحة رغوة مع الشريط.</li>
	<li>افتح جانبي الصدر للحث على الاختناق السريع. قم بعمل شق 1-2 مم في الزائدة الأذينية اليمنى. أدخل إبرة التسريب في البطين الأيسر. تنقع 20 مل من محلول ملحي مبرد مسبقا و 20 مل من محلول بارافورمالدهايد المثلج 4٪.</li>
	<li>قطع رأس الفأر بمقص تشريح الأنسجة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). قم بإزالة الجلد عن طريق إجراء شق على طول خط الوسط من الرقبة إلى الأنف ثم كشف الجمجمة. تخلص من العضلات المتبقية على الجمجمة بالملقط أو المقص.</li>
	<li>ضع طرف شفرة واحدة من المقص الناعم بين الثقبة العظمى والدماغ ، مع الحافة الحادة التي تواجه العظم ، في نهاية المنضدة من الخيط السهمي الأوسط. المضي قدما في الانزلاق وقطع الجمجمة على طول خياطة منتصف السهمي. استخدم ملقط لإزالة الجمجمة ، وكشف الدماغ المكشوف. ملاحظة: توخي الحذر لتجنب التسبب في أي ضرر للدماغ أثناء العملية. قبل إزالة رقائق العظام ، انزع بعناية أي سحايا قد تكون متصلة بالجمجمة. هذا الاحتياط ضروري لمنع التقطيع غير المقصود لأنسجة المخ أثناء العملية.</li>
	<li>قم بتشغيل قوة كريوستات الميكروتوم الدوار (انظر جدول المواد) واضبط درجة حرارة الغرفة على -20 درجة مئوية. صب القليل من مركب OCT لتغطية سطح قرص العينة بالتساوي. ضعه في غرفة التبريد واسمح ل OCT بالتصلب.</li>
	<li>قم بتوصيل القرص برأس العينة. اجعل الشفرة أقرب إلى الكتلة وقم بقص كتلة OCT لعمل مستوى مسطح مواز للقرص.</li>
	<li>قطع الدماغ في اتجاه إكليلي بعيدا عن موقع الحقن في قالب شريحة الدماغ بواسطة شفرة حلاقة. ضع أنسجة المخ التي تحتوي على موقع الحقن مع الجانب المقطوع لأسفل على المستوى المسطح OCT.<ol><li>صب OCT على الدماغ ووضع القرص في غرفة التبريد ، مما يسمح لكتلة العينة بالتصلب. صب OCT بشكل متكرر على الدماغ حتى يتم دمج الدماغ بالكامل مع OCT. ملاحظة: أضف مركب OCT طبقة تلو الأخرى. بمجرد تجميد الطبقة السابقة من OCT ، صب الطبقة اللاحقة من مركب OCT على الدماغ.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بقص كتلة العينة حتى تقترب المنطقة المستهدفة. اصنع عدة أقسام من مستوى موقع الحقن. اجمع شرائح الدماغ الإكليلي في طبق من 6 آبار يحتوي على برنامج تلفزيوني بدرجة حرارة الغرفة باستخدام فرشاة كتابة صغيرة محفوظة عند -20 درجة مئوية. ملاحظة: اضبط سمك القطع على سمك أكبر لتقليم الكتلة ، ثم اضبط سمك القطع على 40 ميكرومتر عندما تقترب الشفرة من موقع الحقن. إذا تم استخدام متتبعات الدوائر العصبية ، فلن يتم التضحية بالفئران على الفور. ضع الماوس في قفص تعافي معقم بعد العملية الجراحية فوق بطانية تدفئة للتعافي من التخدير. أعد الفئران إلى القفص الأصلي أو قفص جديد بمجرد استيقاظها.</li>
</ol>4. التصوير
<ol><li>اغسل OCT بدرجة حرارة الغرفة PBS. استخدم فرشاة لالتقاط أقسام الدماغ ووضعها على شريحة. اترك الأقسام تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>راقب المنطقة المحقونة بصريا أو استخدم المجهر عندما تكون النوى المستهدفة ضئيلة. قارن موقع الصبغة المحقونة بالمنطقة المقابلة في أطلس الدماغ. ملاحظة: اضبط قيم المحاور x وy وz وفقا لاتجاه ومسافة انحراف نقطة الحقن. قد يكون من الضروري تكرار كافة الخطوات في هذا البروتوكول عدة مرات لتحديد الإحداثيات بدقة.</li>
</ol>

تحسين دقة الحقن المجهري التجسيمي في الفئران

<ol>
	<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor-mediated+projection-specific+regulation+of+depressive-like+and+nociceptive+behaviors+in+the+mesolimbic+reward+circuitry.">Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry.</a> Pain. 159 (1), 175 (2018).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+pain+relief+pathways+originating+from+primary+motor+cortex.">Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex.</a> Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).</li><li>Laing, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+hypothalamic+parvalbumin+neurons+are+glutamatergic+and+promote+escape+behavior.">Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior.</a> Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).</li><li>Perens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+3D+mouse+brain+atlas+framework+with+the+skull-derived+coordinate+system.">Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system.</a> Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).</li><li>Adhikari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basomedial+amygdala+mediates+top-down+control+of+anxiety+and+fear.">Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear.</a> Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).</li><li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+infralimbic+cortex+to+paraventricular+thalamus+mediate+fear+extinction+retrieval.">Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval.</a> Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).</li><li>Ansarifar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+volume+and+expression+time+in+an+aav-delivered+channelrhodopsin.">Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin.</a> Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).</li><li>Gonzalez, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+AAV+capsid+evolution+strategies+for+enhanced+CNS+gene+delivery.">Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+parallel+medial+prefrontal+cortex-amygdala+pathways+mediate+memory+deficits+via+glutamatergic+projection+in+surgery+mice.">Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice.</a> Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).</li><li>Koren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insular+cortex+neurons+encode+and+retrieve+specific+immune+responses.">Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses.</a> Cell. 184 (25), 6211 (2021).</li><li>Poller, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+motor+and+fear+circuits+regulate+leukocytes+during+acute+stress.">Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress.</a> Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+habenula+underlies+the+antidepressive+effects+of+light+therapy.">A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy.</a> Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+the+periaqueductal+gray+area+for+the+antinociceptive+effects+of+bright+light+treatment.">A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment.</a> Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+stepwise+tracing+of+polysynaptic+neuronal+circuits+with+replication-deficient+pseudorabies+virus.">Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus.</a> Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).</li></ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

وصفت هذه المقالة استراتيجية مستقرة للتحقق من دقة حقن الدماغ التجسيمية 5,6 بسرعة أكبر وببساطة قبل تتبع الفيروس ، ولكن الجانب الذي لا يمكن الاستغناء عنه من التعبير الجيني للمراسل في منطقة الدماغ أمر بالغ الأهمية لوضع العلامات على منطقة الدماغ. سمحت الصبغة الز...

تتطلب جميع أدوات التعديل العصبي الحديثة تقريبا ، بما في ذلك تسجيل الكالسيوم في الجسم الحي ، والأدوات البصرية الوراثية ، والأدوات الكيميائية الجينية ، استخدام إحداثيات مجسمة لاستهداف منطقة الدماغ محل الاهتمام1،2،3 ، مما يشكل أساس التلاعب العصبي. يتم تعريف الإحداثيات المجسمة لمناطق دماغ الفأر فيما يتعلق ب bregma و lambda ، المعالم العظمية على الجمجمة ، والتي تشكل ما يسمى بنظام الإحداثيات التجسيمية المشتقة من الجمجمة. يمكن أن يكون البريغما أو لامدا بمثابة نقطة الصفر للإحداثيات ثلاثية الأبعاد. المحاور الثلاثة هي الأمامية الخلفية (AP) ، والمتوسطة الجانبية (ML) ، والظهرية البطنية (DV) ، والتي تمثل المحاور y و x و z على الشاشة الرقمية للأدوات المجسمة. بالنسبة لمناطق الدماغ المعروفة ، يمكن الحصول على معلمات الإحداثيات المجسمة لمنطقة معينة من أطالس دماغ الفأر4 (على سبيل المثال ، Paxinos ودماغ فأر فرانكلين في الإحداثيات المجسمة) و / أو الأدبيات المنشورة 5,6. ومع ذلك ، من الضروري إجراء مزيد من التحقق بسبب الاختلافات في معدات التجسيم وعمر / أعداد الفئران المستخدمة من قبل باحثين مختلفين.
الهيكل هو أساس الوظيفة. تشكل الدوائر العصبية الأساس للعديد من وظائف الدماغ ، مثل الأنشطة المعرفية والعاطفة والذاكرة والوظائف الحسية والحركية1. يعد وضع العلامات على البنية والتلاعب بنشاط الدوائر العصبية أمرا حيويا لفهم وظيفة دائرة عصبية معينة. على مدى العقود الماضية ، تطورت المتتبعات العصبية عبر أجيال عديدة. اعتمدت الأبحاث المبكرة أغلوتينين جنين القمح (WGA) و phaseolus vulgaris agglutinin (PHA) كمتتبعات تقدمية ، والفلوروغولد (FG) ، الوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (CTB) ، الكاربوسيانين كمتتبعات رجعية. ومع ذلك ، على عكس المتتبعات الفيروسية ، لا يمكن لهذه المقتفيات العصبية التقليدية دمج الجينات الخارجية في المضيف ، ولا تتمتع بانتقائية نوع الخلية. في الوقت الحاضر ، أصبحت الاستراتيجية الفيروسية اقتراحا مهما خلال أبحاث علم الأعصاب الأساسية. لأغراض بحثية مختلفة ، يمكن اختيار أدوات فيروسية مختلفة 7,8. هناك فيروسات غير عبر المشبكي ، وفيروسات عبر متعدد المشابك (رجعية وتقدمية) ، وفيروسات عبر أحادي المشبك (رجعي وأمامي). تحتوي كل فئة على عدة أنواع لها خصائص كل منها.
تستغرق عملية الإعطاء والتعبير الفيروسي وقتا طويلا وموارد كثيفة الاستخدام ، وغالبا ما تستغرق أسابيع أو حتى أكثر. من بين النواقل الفيروسية المختلفة ، تم تحديد الفيروس المرتبط بالغدي كوسيلة واعدة لتوصيل الجينات ، مما يوفر نافذة واسعة تتراوح من 3 إلى 8 أسابيع بعد الحقن للإجراء التجريبي 7,8. مع تطور AAV ، يمكن إجراء التحليل بعد 2-3 أسابيع من إعطاء 9,10. تتطلب متتبعات الدوائر العصبية الأخرى ، مثل فيروس داء الكاذب (PRV) وفيروس داء (RV) ، فترة تتبع لا تقل عن 2-7 أيام11،12،13،14،15. وبالتالي ، فإن التحقق الأولي من موقع الحقن قبل مراقبة إشارات التألق يكون فعالا من حيث الوقت والتكلفة.
لتسهيل التحقق البسيط والسريع من الحقن التجسيمية ، في هذه الدراسة ، يتم إعطاء صبغة قبل النواقل الفيروسية ، ويمكن التشريح بالتبريد الباحثين من مراقبة موقع الحقن وتتبعه في غضون 30 دقيقة بعد الحقن.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;L, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>65458-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-200-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3%H2O2 solution</td>
			<td>Lircon Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Shengyou Biotech</td>
			<td>20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anerdian</td>
			<td>Likang High-tech</td>
			<td>31001002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti roll plate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047742497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bend toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellsens dimension software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-Fluoromount-G</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Longxiang</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brushes</td>
			<td>HWAHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>y00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps straight with tooth</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J31010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion needle 0.7 mm</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine hydrochloride injection</td>
			<td>Harvest Pharmaceutical Company</td>
			<td>71230803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male C57/BL mice</td>
			<td>The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research&#8211;BK Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice coronal brain slice mold</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-02-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Cisen Pharmaceutical Company</td>
			<td>G23HDM9M4S5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piette 2-200 &#956;L</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>4642080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaving blades</td>
			<td>BFYING</td>
			<td>91560618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Citotest Scientific</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Holder</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>Aibei Biotechnology</td>
			<td>M2910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preliminary validation of stereotaxic injection coordinates via cryosectioning

يشكل الحقن التجسيمي لمنطقة معينة من الدماغ تقنية تجريبية أساسية في علم الأعصاب الأساسي. عادة ما يبني الباحثون اختيارهم لمعلمات الحقن التجسيمي على أطالس دماغ الفئران أو المواد المنشورة التي تستخدم مجموعات / أعمار مختلفة من الفئران ومعدات تجسيمية مختلفة ، مما يستلزم مزيدا من التحقق من صحة معلمات الإحداثيات المجسمة. تعتمد فعالية تصوير الكالسيوم والتلاعب الكيميائي الوراثي والبصري الوراثي على التعبير الدقيق لجينات المراسل داخل المنطقة محل الاهتمام ، وغالبا ما تتطلب عدة أسابيع من الجهد. وبالتالي ، فهي مهمة تستغرق وقتا طويلا إذا لم يتم التحقق من إحداثيات منطقة الدماغ المستهدفة مسبقا. باستخدام صبغة مناسبة بدلا من الفيروس وتنفيذ التقسيم بالتبريد ، يمكن للباحثين مراقبة موقع الحقن مباشرة بعد إعطاء الصبغة. هذا يسهل التعديلات في الوقت المناسب لتنسيق المعلمات في الحالات التي توجد فيها تناقضات بين موقع الحقن الفعلي والموضع النظري. هذه التعديلات تعزز بشكل كبير دقة التعبير الفيروسي داخل المنطقة المستهدفة في التجارب اللاحقة.

Nearly all modern neuromodulation tools, including in vivo calcium recording, optogenetic, and chemogenetic tools, require the use of stereotaxic coordinates to target the brain area of interest1,2,3, forming the foundation of neural manipulation. Stereotaxic coordinates for mouse brain regions are defined in relation to bregma and lambda, the bony landmarks on the cranium, forming the so-called skull-derived stereotaxic coordinate system. Either bregma or lambda can serve as the zero point of the three-dimensional coordinates. The three axes are anteroposterior (AP), mediolateral (ML), and dorsoventral (DV), representing the y, x, and z axes on the digital display of stereotaxic instruments. For well-known brain regions, the stereotaxic coordinate parameters of a specific area can be obtained from mouse brain atlases4 (e.g., Paxinos and Franklin&#39;s mouse brain in stereotaxic coordinates) and/or the published literature5,6. However, further validation is necessary due to variations in stereotaxic equipment and the age/populations of mice used by different researchers.
Structure is the basis of function. Neural circuits form the foundation for many brain functions, such as cognitive activities, emotion, memory, sensory, and motor functions1. Labeling the structure and manipulating the activity of neural circuits are vital for understanding the function of a specific neural circuit. Over the past decades, neural tracers have evolved through many generations; early research adopted wheat germ agglutinin (WGA) and phaseolus vulgaris agglutinin (PHA) as anterograde tracers, and fluorogold (FG), cholera toxin subunit B (CTB), carbocyanine as retrograde tracers. However, unlike viral tracers, these traditional neural tracers cannot integrate exogenous genes into the host, nor do they have cell type selectivity. Nowadays, the viral strategy has become an important proposition during basic neuroscience research. For different research purposes, various viral tools can be selected7,8. There are non-transsynaptic viruses, trans-multisynaptic viruses (retrograde and anterograde), and trans-monosynaptic viruses (retrograde and anterograde). Each category contains several types with respective characteristics.
The process of viral administration and expression is highly time- and resource-intensive, often taking weeks or even longer. Among various viral vectors, adeno-associated virus has been identified as a promising means for gene delivery, providing a wide window ranging from 3 to 8 weeks post-injection for the experimental procedure7,8. As AAV evolves, analysis can be performed 2-3 weeks after administration9,10. Other neural circuit tracers, such as pseudorabies virus (PRV) and rabies virus (RV), also require a tracing period of at least 2-7 days11,12,13,14,15. Thus, a preliminary verification of the injection site before observing fluorescence signals is both time- and cost-effective.
To facilitate a simple and rapid verification of stereotaxic injections, in this study, a dye is administered before viral vectors, and cryosectioning enables researchers to observe the injection site and track it within 30 min post-injection.

تسليط الضوء على المؤلف: تسريع أبحاث الضعف الإدراكي في الفئران من خلال الحقن التجسيمي والأصباغ الفعالة من حيث التكلفة

التحقق الأولي من إحداثيات الحقن التجسيمي عن طريق التقسيم بالتبريد

Our research primarily focus on investigating the neural circuits mechanism underlying cognitive impairment in mice. And we frequently employ brain stereotaxic techniques in these studies. Our objective is to optimize and accelerate the verification process for stereotaxic injection sites using dyes, ensuring that it becomes a simple and rapid procedure.Various strategies have become crucial in neuroscience research through stereotaxic injection of virus. This is followed by observation of fluorescent markers in tissue slice to confirm the injection sites, a process that takes several weeks to complete. Our protocol offers advantages over other techniques by saving at least three days of dehydration time and using a cost-effective dye for quicker identification of injection sites.It may save weeks compared with no preliminary verification.

نجحت هذه الدراسة في تحديد موقع الحقن في غضون 30 دقيقة باستخدام الطريقة المثبتة. في البداية ، تم حقن محلول تحميل عينة SDS-PAGE يحتوي على بروموفينول أزرق في LDTgV في الفئران C57 / BL. يوضح الشكل 1 أ تمثيلا تخطيطيا لحقن محلول الصبغة. يوضح الشكل 1 ب توزيع الصبغة الزرقاء في LDT...

يصف هذا البروتوكول استراتيجية عملية للتعجيل بخطوة التحقق من إحداثيات الحقن التجسيمي قبل إجراء تتبع الفيروس باستخدام الأصباغ والأقسام المجمدة.

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

يركز بحثنا في المقام الأول على التحقيق في آلية الدوائر العصبية الكامنة وراء الضعف الإدراكي في الفئران. وكثيرا ما نستخدم تقنيات تجسيم الدماغ في هذه الدراسات. هدفنا هو تحسين وتسريع عملية التحقق لمواقع الحقن التجسيمي باستخدام الأصباغ ، مما يضمن أن يصبح إجراء بسيطا وسريعا.أصبحت الاستراتيجيات المختلفة حاسمة في أبحاث علم الأعصاب من خلال الحقن التجسيمي للفيروس. يتبع ذلك ملاحظة علامات الفلورسنت في شريحة الأنسجة لتأكيد مواقع الحقن ، وهي عملية تستغرق عدة أسابيع حتى تكتمل. يوفر بروتوكولنا مزايا مقارنة بالتقنيات الأخرى من خلال توفير ثلاثة أيام على الأقل من وقت الجفاف واستخدام صبغة فعالة من حيث التكلفة لتحديد مواقع الحقن بشكل أسرع.قد يوفر أسابيع مقارنة بعدم وجود تحقق أولي.

preliminary-validation-stereotaxic-injection-coordinates-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

832 Views.  Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. يركز بحثنا في المقام الأول على التحقيق في آلية الدوائر العصبية الكامنة وراء الضعف الإدراكي في الفئران. وكثيرا ما نستخدم تقنيات تجسيم الدماغ في هذه الدراسات. هدفنا هو تحسين وتسريع عملية التحقق لمواقع الحقن التجسيمي باستخدام الأصباغ ، مما يضمن أن يصبح إجراء بسيطا وسريعا.

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تسريع أبحاث الضعف الإدراكي في الفئران من خلال الحقن التجسيمي والأصباغ الفعالة من حيث التكلفة

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their choice of stereotaxic injection parameters on mouse brain atlases or published materials that employed various populations/ages of mice and different stereotaxic equipment, necessitating further validation of the stereotaxic coordinate parameters. The efficacy of calcium imaging, chemogenetic, and optogenetic manipulations relies on the precise expression of reporter genes within the region of interest, often requiring several weeks of effort. Thus, it is a time-consuming task if the coordinates of the target brain region are not verified in advance. Using an appropriate dye instead of a virus and implementing cryosectioning, researchers can observe the injection site immediately following dye administration. This facilitates timely adjustments to coordinate parameters in cases where discrepancies exist between the actual injection site and the theoretical position. Such adjustments significantly enhance the accuracy of viral expression within the target region in subsequent experiments.

The present protocol describes a practical strategy to expedite the verification step of stereotaxic injection coordinates before conducting viral tracing using dyes and frozen sections.