הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '82101249 ל- XY Sun), קרן המחקר לפוסט-דוקטורט של סין (מענק מס '2022M722125 ל- XY Sun). תוכנית השייט של שנחאי (מענק מס' 21YF1425100 לש.ש. צ'ן). פרויקט מיוחד למחקר קליני של ועדת הבריאות העירונית של שנחאי (מענק מס '202340088 לג'יי ג'ואו). הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '82101262 ל- X Zhang, מענק מס '82101287 ל- SH Chen).

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) ולמדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. המחקר הנוכחי אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים רנג'י, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאוטונג בשנחאי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6J בני שמונה שבועות. בעלי החיים הושגו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ושוכנו בכלובים סטנדרטיים (22°C ±-2°C, 12 שעות/12 שעות מחזור אור/חושך, מזון ומים עד לליביטום).
1. בחירת אזורי מטרה במוח
הערה: זהו הליך סטרילי. ודא שכל כלי הניתוח מעוקרים. יש לרסס את הכפפות באלכוהול לפני מגע עם כלי ניתוח. הימנע מלגעת בקצה המכשירים או באזור הניתוח עם כפפות. ודא שהעכבר מורדם כראוי לפני תחילת ההליך על ידי בדיקת אובדן רפלקסים נכונים וללא תגובה לגירוי עורי. לפני הקידוח וההזרקה, עקוב מקרוב אחר קצב הנשימה (60-220 נשימות לדקה, ממוצע 100-150 נשימות לדקה) ומשרעת הנשימה (צריכה להיות עקבית ולא רדודה או עמוקה מדי). יש לציין כל שינוי משמעותי בקצב הנשימה או באמפליטודה.
<ol><li>מרדימים את העכבר עם הזרקה intraperitoneal של 1.25% tribromoethanol (250 מ"ג / ק"ג) באמצעות מחט 29 גרם. יש לגלח את השיער על הגולגולת ברגע שהרפלקס הנכון נעלם. אבטח את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית (ראה טבלת חומרים) על ידי קיבוע החותכות העליונות עם מהדק אף וייצוב הראש באמצעות שני מוטות אוזניים.</li>
	<li>יש למרוח משחה אופתלמית למניעת יובש בעיניים. יש לחטא את הקרקפת על ידי ספוג שלוש פעמים עם אנרדיאן (תמיסת חיטוי; ראו טבלת חומרים). הזריקו 0.2 מ"ל של לידוקאין 1% תת עורית באמצעות מחט אינסולין 29 גרם כדי לספק שיכוך כאבים מקומי.</li>
	<li>בצע חתך של 0.5 ס"מ באמצעות מספריים בעין כדי לחשוף את הגולגולת. השתמש בצמר גפן טבול עם 3% H2O2 כדי לקרצף את הגולגולת החשופה כדי להסיר את periosteum. הניחו לגולגולת להתייבש.</li>
	<li>הצמידו את המקדחה למכשיר הסטריאוטקסי. כוונן את ידיות הזרועות הסטריאוטקסיות כך שימקמו את קצה המקדחה בדיוק בברגמה בעזרת זכוכית מגדלת ורשום את ערך ציר z באמצעות צג LCD דיגיטלי.<ol><li>כוונן את הידיות ומקם את קצה המקדחה בלמדא ורשום את הערך של ציר z. כוונן את מהדק האף ואת מוטות האוזניים כדי לקרב שני ערכי z, וחזור על השלבים לעיל עד שההפרש בין שני ערכי z קטן מ- 0.1 מ"מ. הערה: צירי x, y ו-z בצג LCD דיגיטלי תואמים לצירים בינוניים (ML), אנטרופוסטריים (AP) וגב-ונטרליים (DV), בהתאמה. הברגמה והלמבדה יכולות להיחשב כנמצאות באותו מישור אופקי כאשר ההפרש בין שני ערכי z קטן מ-0.1 מ"מ.</li>
	</ol></li>
	<li>ודא את רמת שמאל-ימין של המוח. התאימו את מוטות האוזניים המחוברים למסגרת הסטריאוטקסית באותו קנה מידה. קח את הגרעין tegmental laterodorsal, החלק הגחוני (LDTgV), למשל; הקואורדינטות הסטריאוטקסיות שלו הן -5.2 עבור x, +0.8 עבור y, -4.0 עבור z, על פי Paxinos ואטלס מוח העכבר של פרנקלין16.<ol><li>כוונן את מוט האוזן כדי לבצע את המקדחה ב- (-5.2, +0.8) כדי למדוד את ערך z בכיוון הגב-גחוני והזז את המקדחה ל- (-5.2, -0.8) כדי למדוד את ערך z. הערה: שמאל-ימין נחשב ברמה שווה כאשר ההפרש בין שני ערכי z קטן מ- 0.2 מ"מ. יש להחדיר את מוטות האוזניים למקום הנכון מכיוון שהבשר השמיעתי החיצוני סימטרי. אם ההפרש בין שני ערכי z הוא יותר מ-0.5 מ"מ, ייתכן שמוט האוזן יוכנס למקום הלא נכון.</li>
	</ol></li>
	<li>מקם שוב את המקדחה לברגמה והגדר שלוש קואורדינטות בצג הדיגיטלי LCD לאפס. מקם את המקדחה מעל אזור העניין באמצעות קואורדינטות ייחוס. התחל את התרגיל.<ol><li>מנמיכים בהדרגה את המקדחה באמצעות הזרוע האנכית עד שהיא חודרת את הגולגולת. יש לפנות פסולת ודם באמצעות צמר גפן. הערה: היזהר שלא לפגוע ברקמת המוח.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת תמיסת צבע ומיקרו-הזרקה למוח
<ol><li>יש ליטול 25 μL של מאגר טעינה SDS-PAGE המכיל ברומופנול כחול (ראה טבלת חומרים) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 200 μL. הוסף 50 μL של ddH2O לצינור כדי להכין את תמיסת הצבע.</li>
	<li>כסו את חלון הגולגולת בפד צמר גפן לח במי מלח. להבטיח פטנט microsyringe על ידי שאיפה וגירוש מלוחים שוב ושוב. טען 0.3 מיקרוליטר של צבע לתוך מזרק מיקרו. חבר את המזרק ואת המיקרו-מזרק הסטריאוטקסי הממונע לזרוע הסטריאוטקסית.</li>
	<li>מקם את קצה המזרק בברגמה והגדר את הקואורדינטות לאפס בצג LCD דיגיטלי. להתאים את המחט לאזור העניין על פי קואורדינטות התייחסות. הגדר את מהירות ההזרקה ל -0.1 μL / min והפעל את המיקרו-מזרק הממונע, המספק 0.3 μL של צבע כחול לאזור המטרה. השאירו את המזרק במקומו לפחות 10 דקות לפני שתמשכו את המזרק באיטיות. הערה: ניתן להשתמש בצבעים שונים באותם עכברים כדי להבחין בין אזורים קרובים. בדוק צבעים אחרים עבור ריכוזים מתאימים בהתבסס על התכונות הפיזיות שלהם. מומלץ להשתמש בפורמולה הכחולה ברומופנול ולשטוף היטב את המזרק לפני ואחרי השימוש כדי למנוע סתימות. התאמת נפחי ההזרקה בהתבסס על דיפוזיית צבע.</li>
</ol>3. קצירת רקמת מוח והקפאה
<ol><li>שחרר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית. להרדים את העכבר עם הזרקה intraperitoneal של 50 מ"ג / ק"ג נתרן pentobarbital באמצעות מחט 29 גרם. אבטח את העכבר על לוח קצף באמצעות סרט הדבקה.</li>
	<li>פתח את שני צידי בית החזה כדי לגרום לחנק מהיר. בצע חתך של 1-2 מ"מ בתוספתן פרוזדורים ימני. הכנס מחט עירוי לחדר השמאלי. להחדיר 20 מ"ל של מלוחים מקוררים מראש ו 20 מ"ל של תמיסת 4% paraformaldehyde קר.</li>
	<li>ערפו את ראשו של העכבר בעזרת מספריים לניתוח רקמות (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). הסר את העור על ידי ביצוע חתך לאורך קו האמצע מהצוואר אל האף ולאחר מכן לחשוף את הגולגולת. נקה שאריות שריר על הגולגולת עם מלקחיים או מספריים.</li>
	<li>מקמו את קצה להב אחד של המספריים העדינים בין הפתח מגנום למוח, כאשר הקצה החד פונה אל העצם, בקצה הרוסטרלי של התפר האמצעי. המשך להחליק ולחתוך את הגולגולת לאורך התפר באמצע sagittal. השתמשו במלקחיים כדי להסיר את הגולגולת, וחשפו את המוח החשוף. הערה: יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מגרימת נזק למוח במהלך הניתוח. לפני הסרת שבבי העצם, לקלף בזהירות את כל קרומי המוח שעשויים להיות מחוברים לגולגולת. אמצעי זהירות זה חיוני למניעת חיתוך לא מכוון של רקמת המוח במהלך התהליך.</li>
	<li>הפעל את עוצמת הקריוסטט הסיבובי של המיקרוטום (ראה טבלת חומרים) והגדר את טמפרטורת התא ל -20 מעלות צלזיוס. יוצקים מעט תרכובת OCT כדי לכסות את פני השטח של דיסק הדגימה באופן שווה. הכניסו אותו לתא ההקפאה ואפשרו ל-OCT להתמצק.</li>
	<li>חבר את הדיסק לראש הדגימה. קרב את הלהב לבלוק וחתוך את בלוק OCT כדי ליצור מישור שטוח המקביל לדיסק.</li>
	<li>חותכים את המוח בכיוון העטרה הרחק מאתר ההזרקה בתבנית פרוסת מוח על ידי להב גילוח. הניחו את רקמת המוח המכילה את אתר ההזרקה עם הצד החתוך כלפי מטה במישור השטוח OCT.<ol><li>שפכו OCT על המוח והכניסו את הדיסק לתא ההקפאה, מה שמאפשר לגוש הדגימה להתמצק. שפכו OCT שוב ושוב על המוח עד שהמוח מוטמע במלואו ב-OCT. הערה: הוסף את OCT מורכב שכבה אחר שכבה. לאחר שהשכבה הקודמת של OCT הוקפאה, שפכו את השכבה הבאה של תרכובת OCT על המוח.</li>
	</ol></li>
	<li>חתוך את גוש הדגימה עד שאזור היעד מתקרב. בצע מספר קטעים מרמת אתר ההזרקה. אספו את פרוסות המוח העטרה לתוך צלחת בת 6 בארות המכילה PBS בטמפרטורת החדר באמצעות מברשת כתיבה קטנה הנשמרת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. הערה: הגדר את עובי החיתוך לעובי גדול יותר כדי לחתוך את הבלוק, ולאחר מכן הגדר את עובי החיתוך ל- 40 מיקרומטר כאשר הלהב מתקרב לאתר ההזרקה. אם משתמשים בעוקבים אחר מעגלים עצביים, העכברים אינם מוקרבים מיד. הניחו את העכבר בכלוב התאוששות סטרילי לאחר הניתוח מעל שמיכת חימום לצורך התאוששות מהרדמה. החזירו את העכברים לכלוב המקורי או לכלוב חדש ברגע שיתעוררו.</li>
</ol>4. הדמיה
<ol><li>שטפו את ה-OCT עם PBS בטמפרטורת החדר. השתמשו במברשת כדי לאסוף אזורים במוח ולמקם אותם על שקופית. הניחו לחלקים להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>התבונן באזור המוזרק באופן חזותי או השתמש במיקרוסקופ כאשר גרעיני המטרה זעירים. השווה את מיקום הצבע המוזרק לאזור המתאים באטלס המוח. הערה: התאם את הערכים של צירי x, y ו- z בהתאם לכיוון ולמרחק של סטיית נקודת ההזרקה. ייתכן שיהיה צורך לחזור על כל השלבים בפרוטוקול זה מספר פעמים כדי לקבוע את הקואורדינטות במדויק.</li>
</ol>

אופטימיזציה של דיוק מיקרו-הזרקה סטריאוטקסית בעכברים

<ol>
	<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor-mediated+projection-specific+regulation+of+depressive-like+and+nociceptive+behaviors+in+the+mesolimbic+reward+circuitry.">Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry.</a> Pain. 159 (1), 175 (2018).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+pain+relief+pathways+originating+from+primary+motor+cortex.">Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex.</a> Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).</li><li>Laing, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+hypothalamic+parvalbumin+neurons+are+glutamatergic+and+promote+escape+behavior.">Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior.</a> Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).</li><li>Perens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+3D+mouse+brain+atlas+framework+with+the+skull-derived+coordinate+system.">Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system.</a> Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).</li><li>Adhikari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basomedial+amygdala+mediates+top-down+control+of+anxiety+and+fear.">Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear.</a> Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).</li><li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+infralimbic+cortex+to+paraventricular+thalamus+mediate+fear+extinction+retrieval.">Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval.</a> Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).</li><li>Ansarifar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+volume+and+expression+time+in+an+aav-delivered+channelrhodopsin.">Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin.</a> Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).</li><li>Gonzalez, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+AAV+capsid+evolution+strategies+for+enhanced+CNS+gene+delivery.">Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+parallel+medial+prefrontal+cortex-amygdala+pathways+mediate+memory+deficits+via+glutamatergic+projection+in+surgery+mice.">Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice.</a> Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).</li><li>Koren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insular+cortex+neurons+encode+and+retrieve+specific+immune+responses.">Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses.</a> Cell. 184 (25), 6211 (2021).</li><li>Poller, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+motor+and+fear+circuits+regulate+leukocytes+during+acute+stress.">Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress.</a> Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+habenula+underlies+the+antidepressive+effects+of+light+therapy.">A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy.</a> Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+the+periaqueductal+gray+area+for+the+antinociceptive+effects+of+bright+light+treatment.">A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment.</a> Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+stepwise+tracing+of+polysynaptic+neuronal+circuits+with+replication-deficient+pseudorabies+virus.">Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus.</a> Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

מאמר זה תיאר אסטרטגיה יציבה לאימות הדיוק של זריקות מוח סטריאוטקסיות 5,6 מהר יותר ופשוט לפני מעקב נגיפי, אך ההיבט חסר התחליף של ביטוי גנים מדווח באזור המוח הוא חיוני לתיוג אזור המוח. הצבע הכחול בו השתמשנו איפשר הדמיה מיידית של אתר ההזרקה.
מספר ש?...

כמעט כל הכלים הנוירומודולטיביים המודרניים, כולל רישום סידן in vivo, כלים אופטוגנטיים וכימוגנטיים, דורשים שימוש בקואורדינטות סטריאוטקסיות כדי להתמקד באזור המוח המעניין 1,2,3, ויוצרים את הבסיס למניפולציה עצבית. קואורדינטות סטריאוטקסיות עבור אזורי מוח של עכברים מוגדרות ביחס לברגמה ולמבדה, ציוני הדרך הגרמיים על הגולגולת, ויוצרים את מה שמכונה מערכת קואורדינטות סטריאוטקסית שמקורה בגולגולת. ברגמה או למדא יכולות לשמש כנקודת האפס של הקואורדינטות התלת-ממדיות. שלושת הצירים הם אנטרופוסטריורי (AP), בינוני (ML) ודורסו-ונטרלי (DV), המייצגים את צירי y, x ו-z בתצוגה דיגיטלית של מכשירים סטריאוטקסיים. עבור אזורי מוח ידועים, ניתן לקבל את פרמטרי הקואורדינטות הסטריאוטקסיות של אזור מסויםמאטלסים 4 של מוח עכבר (למשל, מוח העכבר של פקסינוס ופרנקלין בקואורדינטות סטריאוטקסיות) ו/או מהספרות שפורסמה 5,6. עם זאת, יש צורך בתיקוף נוסף בשל שינויים בציוד סטריאוטקסי ובגיל/אוכלוסיות העכברים המשמשים חוקרים שונים.
מבנה הוא הבסיס לתפקוד. מעגלים עצביים מהווים את הבסיס לתפקודי מוח רבים, כגון פעילויות קוגניטיביות, רגש, זיכרון, תפקודים חושיים ומוטוריים1. תיוג המבנה ומניפולציה של הפעילות של מעגלים עצביים חיוניים להבנת תפקודו של מעגל עצבי מסוים. במהלך העשורים האחרונים, עוקבים עצביים התפתחו במשך דורות רבים; מחקרים מוקדמים אימצו את נבט החיטה אגלוטינין (WGA) ופאזולוס וולגריס אגלוטינין (PHA) כעוקבים אנטרוגרדיים, ואת פלואורוגולד (FG), תת-יחידה B של רעלן כולרה (CTB), קרבוציאנין כעוקבים מדרדרים. עם זאת, שלא כמו נותבים נגיפיים, עוקבים עצביים מסורתיים אלה אינם יכולים לשלב גנים אקסוגניים בפונדקאי, וגם אין להם סלקטיביות מסוג התא. כיום, האסטרטגיה הוויראלית הפכה להצעה חשובה במהלך מחקר בסיסי במדעי המוח. למטרות מחקר שונות, ניתן לבחור כלים ויראליים שונים 7,8. ישנם וירוסים שאינם טרנססינפטיים, וירוסים טרנס-מולטיסינפטיים (מדרדרים ואנטרוגרדים), ונגיפים טרנס-מונוסינפטיים (מדרדרים ואנטרוגרדים). כל קטגוריה מכילה מספר סוגים עם מאפיינים מתאימים.
תהליך הניהול והביטוי של הנגיפים הוא עתיר זמן ומשאבים, ולעתים קרובות לוקח שבועות ואף יותר. בין וקטורים נגיפיים שונים, וירוס הקשור באדנו זוהה כאמצעי מבטיח להעברת גנים, ומספק חלון רחב הנע בין 3 ל 8 שבועות לאחר ההזרקה להליך הניסוי 7,8. ככל ש- AAV מתפתח, ניתוח יכול להתבצע 2-3 שבועות לאחר מתן 9,10. עוקבים אחרים של מעגלים עצביים, כגון וירוס פסאודורבי (PRV) ונגיף הכלבת (RV), דורשים גם הם תקופת מעקב של לפחות 2-7 ימים 11,12,13,14,15. לפיכך, אימות ראשוני של אתר ההזרקה לפני צפייה באותות פלואורסצנטיים הוא גם זמן וגם חסכוני.
כדי לאפשר אימות פשוט ומהיר של הזרקות סטריאוטקסיות, במחקר זה, צבע ניתן לפני וקטורים נגיפיים, והקפאה מאפשרת לחוקרים לצפות באתר ההזרקה ולעקוב אחריו תוך 30 דקות לאחר ההזרקה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;L, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>65458-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-200-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3%H2O2 solution</td>
			<td>Lircon Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Shengyou Biotech</td>
			<td>20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anerdian</td>
			<td>Likang High-tech</td>
			<td>31001002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti roll plate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047742497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bend toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellsens dimension software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-Fluoromount-G</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Longxiang</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brushes</td>
			<td>HWAHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>y00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps straight with tooth</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J31010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion needle 0.7 mm</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine hydrochloride injection</td>
			<td>Harvest Pharmaceutical Company</td>
			<td>71230803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male C57/BL mice</td>
			<td>The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research&#8211;BK Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice coronal brain slice mold</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-02-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Cisen Pharmaceutical Company</td>
			<td>G23HDM9M4S5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piette 2-200 &#956;L</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>4642080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaving blades</td>
			<td>BFYING</td>
			<td>91560618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Citotest Scientific</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Holder</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>Aibei Biotechnology</td>
			<td>M2910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preliminary validation of stereotaxic injection coordinates via cryosectioning

הזרקה סטריאוטקסית של אזור מסוים במוח מהווה טכניקה ניסיונית בסיסית במדעי המוח הבסיסיים. חוקרים בדרך כלל מבססים את בחירתם בפרמטרים של הזרקה סטריאוטקסית על אטלסים של מוח עכבר או חומרים שפורסמו שהשתמשו באוכלוסיות/גילאים שונים של עכברים ובציוד סטריאוטקסי שונה, מה שמחייב אימות נוסף של פרמטרי הקואורדינטות הסטריאוטקסיות. היעילות של דימות סידן, מניפולציות כימוגנטיות ואופטוגנטיות מסתמכת על ביטוי מדויק של גנים מדווחים באזור המעניין, הדורש לעתים קרובות מספר שבועות של מאמץ. לכן, זוהי משימה גוזלת זמן אם הקואורדינטות של אזור המוח היעד אינן מאומתות מראש. באמצעות שימוש בצבע מתאים במקום וירוס ויישום קריוסקציה, החוקרים יכולים לצפות באתר ההזרקה מיד לאחר מתן הצבע. זה מאפשר התאמות בזמן כדי לתאם פרמטרים במקרים שבהם קיימים פערים בין אתר ההזרקה בפועל לבין המיקום התיאורטי. התאמות כאלה משפרות באופן משמעותי את דיוק ביטוי הנגיפים באזור המטרה בניסויים הבאים.

Nearly all modern neuromodulation tools, including in vivo calcium recording, optogenetic, and chemogenetic tools, require the use of stereotaxic coordinates to target the brain area of interest1,2,3, forming the foundation of neural manipulation. Stereotaxic coordinates for mouse brain regions are defined in relation to bregma and lambda, the bony landmarks on the cranium, forming the so-called skull-derived stereotaxic coordinate system. Either bregma or lambda can serve as the zero point of the three-dimensional coordinates. The three axes are anteroposterior (AP), mediolateral (ML), and dorsoventral (DV), representing the y, x, and z axes on the digital display of stereotaxic instruments. For well-known brain regions, the stereotaxic coordinate parameters of a specific area can be obtained from mouse brain atlases4 (e.g., Paxinos and Franklin&#39;s mouse brain in stereotaxic coordinates) and/or the published literature5,6. However, further validation is necessary due to variations in stereotaxic equipment and the age/populations of mice used by different researchers.
Structure is the basis of function. Neural circuits form the foundation for many brain functions, such as cognitive activities, emotion, memory, sensory, and motor functions1. Labeling the structure and manipulating the activity of neural circuits are vital for understanding the function of a specific neural circuit. Over the past decades, neural tracers have evolved through many generations; early research adopted wheat germ agglutinin (WGA) and phaseolus vulgaris agglutinin (PHA) as anterograde tracers, and fluorogold (FG), cholera toxin subunit B (CTB), carbocyanine as retrograde tracers. However, unlike viral tracers, these traditional neural tracers cannot integrate exogenous genes into the host, nor do they have cell type selectivity. Nowadays, the viral strategy has become an important proposition during basic neuroscience research. For different research purposes, various viral tools can be selected7,8. There are non-transsynaptic viruses, trans-multisynaptic viruses (retrograde and anterograde), and trans-monosynaptic viruses (retrograde and anterograde). Each category contains several types with respective characteristics.
The process of viral administration and expression is highly time- and resource-intensive, often taking weeks or even longer. Among various viral vectors, adeno-associated virus has been identified as a promising means for gene delivery, providing a wide window ranging from 3 to 8 weeks post-injection for the experimental procedure7,8. As AAV evolves, analysis can be performed 2-3 weeks after administration9,10. Other neural circuit tracers, such as pseudorabies virus (PRV) and rabies virus (RV), also require a tracing period of at least 2-7 days11,12,13,14,15. Thus, a preliminary verification of the injection site before observing fluorescence signals is both time- and cost-effective.
To facilitate a simple and rapid verification of stereotaxic injections, in this study, a dye is administered before viral vectors, and cryosectioning enables researchers to observe the injection site and track it within 30 min post-injection.

מחבר זרקור: האצת מחקר ליקויים קוגניטיביים בעכברים באמצעות הזרקה סטריאוטקסית וצבעים חסכוניים

אימות ראשוני של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות באמצעות קריוסקציה

Our research primarily focus on investigating the neural circuits mechanism underlying cognitive impairment in mice. And we frequently employ brain stereotaxic techniques in these studies. Our objective is to optimize and accelerate the verification process for stereotaxic injection sites using dyes, ensuring that it becomes a simple and rapid procedure.Various strategies have become crucial in neuroscience research through stereotaxic injection of virus. This is followed by observation of fluorescent markers in tissue slice to confirm the injection sites, a process that takes several weeks to complete. Our protocol offers advantages over other techniques by saving at least three days of dehydration time and using a cost-effective dye for quicker identification of injection sites.It may save weeks compared with no preliminary verification.

מחקר זה זיהה בהצלחה את אתר ההזרקה תוך 30 דקות באמצעות השיטה שהודגמה. בתחילה, תמיסת טעינת דגימות SDS-PAGE המכילה ברומופנול כחול הוזרק לתוך LDTgV בעכברי C57/BL. איור 1A מראה ייצוג סכמטי של הזרקת תמיסת הצבע. התפלגות הצבע הכחול ב-LDTgV מודגמת באיור 1B.
ברומופנול...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה מעשית לזרז את שלב האימות של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות לפני ביצוע מעקב נגיפי באמצעות צבעים ומקטעים קפואים.

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

המחקר שלנו מתמקד בעיקר בחקירת מנגנון המעגלים העצביים העומד בבסיס ליקוי קוגניטיבי בעכברים. ואנו משתמשים לעתים קרובות בטכניקות סטריאוטקסיות במוח במחקרים אלה. מטרתנו היא לייעל ולהאיץ את תהליך האימות של אתרי הזרקה סטריאוטקסיים באמצעות צבעים, ולהבטיח שהוא יהפוך להליך פשוט ומהיר.אסטרטגיות שונות הפכו חיוניות במחקר מדעי המוח באמצעות הזרקה סטריאוטקסית של וירוס. זה ואחריו תצפית של סמנים פלואורסצנטיים בפרוסת רקמה כדי לאשר את אתרי ההזרקה, תהליך שלוקח כמה שבועות כדי להשלים. הפרוטוקול שלנו מציע יתרונות על פני טכניקות אחרות על ידי חיסכון של לפחות שלושה ימים של זמן התייבשות ושימוש בצבע חסכוני לזיהוי מהיר יותר של אתרי הזרקה.זה עשוי לחסוך שבועות בהשוואה ללא אימות ראשוני.

preliminary-validation-stereotaxic-injection-coordinates-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

832 Views.  Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. המחקר שלנו מתמקד בעיקר בחקירת מנגנון המעגלים העצביים העומד בבסיס ליקוי קוגניטיבי בעכברים. ואנו משתמשים לעתים קרובות בטכניקות סטריאוטקסיות במוח במחקרים אלה. מטרתנו היא לייעל ולהאיץ את תהליך האימות של אתרי הזרקה סטריאוטקסיים באמצעות צבעים, ולהבטיח שהוא יהפוך להליך פשוט ומ...

Video: מחבר זרקור: האצת מחקר ליקויים קוגניטיביים בעכברים באמצעות הזרקה סטריאוטקסית וצבעים חסכוניים

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their choice of stereotaxic injection parameters on mouse brain atlases or published materials that employed various populations/ages of mice and different stereotaxic equipment, necessitating further validation of the stereotaxic coordinate parameters. The efficacy of calcium imaging, chemogenetic, and optogenetic manipulations relies on the precise expression of reporter genes within the region of interest, often requiring several weeks of effort. Thus, it is a time-consuming task if the coordinates of the target brain region are not verified in advance. Using an appropriate dye instead of a virus and implementing cryosectioning, researchers can observe the injection site immediately following dye administration. This facilitates timely adjustments to coordinate parameters in cases where discrepancies exist between the actual injection site and the theoretical position. Such adjustments significantly enhance the accuracy of viral expression within the target region in subsequent experiments.

The present protocol describes a practical strategy to expedite the verification step of stereotaxic injection coordinates before conducting viral tracing using dyes and frozen sections.