Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (XY Sun'a 82101249 NO'lu hibe), Çin Doktora Sonrası Araştırma Vakfı (XY Sun'a hibe NO. 2022M722125). Şangay Yelken Programı (SH Chen'e hibe NO. 21YF1425100). Şanghay Belediye Sağlık Komisyonu Klinik Araştırma Özel Projesi (J Zhou'ya 202340088 numaralı hibe). Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (X Zhang'a 82101262 NO'lu hibe, SH Chen'e 82101287 NO'lu hibe).

Tüm hayvan deneyleri, Hayvan Araştırmaları Raporlama İn Vivo Deneyleri (ARRIVE) kılavuzlarına ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışma, Şanghay Jiaotong Üniversitesi Tıp Fakültesi, Renji Hastanesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için sekiz haftalık C57BL / 6J erkek fareler kullanıldı. Hayvanlar ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve standart kafeslerde (22 °C ± 2 °C, 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsü, yiyecek ve su ad libitum) barındırıldı.
1. Hedef beyin bölgelerinin seçimi
NOT: Bu steril bir işlemdir. Tüm cerrahi aletlerin sterilize edildiğinden emin olun. Cerrahi aletlerle temas etmeden önce eldivenlere alkol püskürtün. Aletlerin ucuna veya cerrahi bölgeye eldivenle dokunmaktan kaçının. Prosedüre başlamadan önce, doğru reflekslerin kaybını ve kutanöz stimülasyona yanıt verilmemesini kontrol ederek farenin yeterince uyuşturulduğundan emin olun. Delme ve enjeksiyondan önce, solunum hızını (dakikada 60-220 nefes, dakikada ortalama 100-150 nefes) ve solunum genliğini (tutarlı olmalı ve aşırı sığ veya derin olmamalıdır) yakından izleyin. Solunum hızı veya genliğindeki herhangi bir önemli değişiklik not edilmelidir.
<ol><li>Fareyi 29 G'lik bir iğne kullanarak% 1.25 tribromoetanol (250 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Doğrultma refleksi ortadan kalktığında kafatasındaki kılları tıraş edin. Üst kesici dişleri bir burun kelepçesi ile sabitleyerek ve iki kulak çubuğu kullanarak başı sabitleyerek fareyi stereotaksik çerçeveye sabitleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Göz kuruluğunu önlemek için oftalmik merhem sürün. Saç derisini Anerdian (dezenfektan solüsyonu; Malzeme Tablosuna bakınız) ile üç kez sürünerek dezenfekte edin. Lokal analjezi sağlamak için 29 G insülin iğnesi kullanarak deri altına 0.2 mL% 1 lidokain enjekte edin.</li>
	<li>Kafatasını ortaya çıkarmak için göz makası kullanarak 0,5 cm'lik bir kesi yapın. Periosteumu çıkarmak için açıkta kalan kafatasını ovalamak için% 3 H2O2 ile batırılmış bir pamuklu çubuk kullanın. Kafatasının kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Matkabı stereotaksik alete takın. Bir büyüteç yardımıyla matkap ucunu tam olarak bregma'ya konumlandırmak için stereotaksik kolların düğmelerini ayarlayın ve LCD dijital ekranı kullanarak z ekseni değerini kaydedin.<ol><li>Düğmeleri ayarlayın ve matkap ucunu lambdaya yerleştirin ve z ekseninin değerini kaydedin. Burun kelepçesini ve kulak çubuklarını iki z değerini daha yakın hale getirecek şekilde ayarlayın ve iki z değeri arasındaki fark 0,1 mm'den az olana kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın. NOT: LCD dijital ekrandaki x, y ve z eksenleri sırasıyla mediolateral (ML), anteroposterior (AP) ve dorsoventral (DV) eksenlere karşılık gelir. İki z değeri arasındaki fark 0,1 mm'den az olduğunda, bregma ve lambda'nın aynı yatay düzlemde olduğu düşünülebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Beynin sol-sağ düzlüğünden emin olun. Stereotaksik çerçeveye bağlı kulak çubuklarını aynı ölçekte ayarlayın. Örneğin laterodorsal tegmental çekirdeği, ventral kısmı (LDTgV) ele alalım; Paxinos ve Franklin'in fare beyin atlası16'ya göre stereotaksik koordinatları x için -5.2, y için +0.8, z için -4.0'dır.<ol><li>Dorsal-ventral yönde z değerini ölçmek için matkabı (-5.2, +0.8) yapmak için kulak çubuğunu ayarlayın ve z değerini ölçmek için matkabı (-5.2, -0.8) konumuna getirin. NOT: İki z değeri arasındaki fark 0,2 mm'den az olduğunda sol-sağ eşit seviyede kabul edilir. Dış kulak içi kulak eti simetrik olduğu için kulak bantlarının doğru yere yerleştirilmesi gerekir. İki z değeri arasındaki fark 0,5 mm'den fazlaysa, kulak çubuğu yanlış yere takılmış olabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Matkabı tekrar bregma'ya yerleştirin ve LCD dijital ekrandaki üç koordinatı sıfıra ayarlayın. Referans koordinatlarını kullanarak matkabı ilgilenilen bölgenin üzerine yerleştirin. Matkabı başlatın.<ol><li>Dikey kolu kullanarak matkabı kafatasına nüfuz edene kadar kademeli olarak indirin. Pamuklu çubuklar kullanarak kalıntıları ve kanı temizleyin. NOT: Beyin dokusuna zarar vermemeye dikkat edin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Boya çözeltisinin hazırlanması ve beyin mikroenjeksiyonu
<ol><li>Bromofenol mavisi içeren 25 μL SDS-PAGE yükleme tamponunu (Malzeme Tablosuna bakınız) 200 μL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Boya çözeltisini hazırlamak için tüpe 50 μL ddH2O ekleyin.</li>
	<li>Kafatası penceresini tuzlu suyla nemlendirilmiş pamuklu bir bezle örtün. Salini tekrar tekrar aspire ederek ve dışarı atarak mikroşırınga açıklığını sağlayın. Mikro şırıngaya 0,3 μL boya yükleyin. Şırıngayı ve motorlu stereotaksik mikroenjektörü stereotaksik kola takın.</li>
	<li>Şırınga ucunu bregma'ya yerleştirin ve LCD dijital ekranda koordinatları sıfıra ayarlayın. İğneyi referans koordinatlarına göre ilgilenilen bölgeye göre ayarlayın. Enjeksiyon hızını 0,1 μL/dk'ya ayarlayın ve motorlu mikroenjektörü çalıştırarak hedef bölgeye 0,3 μL mavi boya verin. Enjektörü yavaşça çekmeden önce şırıngayı en az 10 dakika yerinde bırakın. NOT: Yakın konumdaki bölgeleri ayırt etmek için aynı farelerde farklı renk boyalar kullanılabilir. Diğer boyaları fiziksel özelliklerine göre uygun konsantrasyonlar için test edin. Tıkanmaları önlemek için bromofenol mavisi formülünün kullanılması ve kullanımdan önce ve sonra şırınganın iyice durulanması önerilir. Enjeksiyon hacimlerini boya difüzyonuna göre ayarlayın.</li>
</ol>3. Beyin dokusu hasadı ve kriyoseksiyon
<ol><li>Fareyi stereotaksik çerçeveden serbest bırakın. Fareyi 29 G'lik bir iğne kullanarak 50 mg / kg pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Fareyi bantlı bir köpük tahtaya sabitleyin.</li>
	<li>Hızlı boğulmaya neden olmak için toraksın her iki tarafını da açın. Sağ atriyal apendikste 1-2 mm'lik bir kesi yapın. Sol ventriküle bir infüzyon iğnesi yerleştirin. 20 mL önceden soğutulmuş salin ve 20 mL buzlu% 4 paraformaldehit çözeltisi demleyin.</li>
	<li>Fareyi doku diseksiyon makasıyla dekapitasyon yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Boyundan buruna kadar orta hat boyunca bir kesi yaparak cildi çıkarın ve ardından kafatasını ortaya çıkarın. Forseps veya makasla kafatasındaki artık kasları temizleyin.</li>
	<li>İnce makasın bir bıçağının ucunu, foramen magnum ile beyin arasına, keskin kenarı kemiğe bakacak şekilde, orta sagital sütürün rostral ucuna yerleştirin. Kafatasını orta sagital sütür boyunca kaydırmaya ve kesmeye devam edin. Kafatasını çıkarmak için forseps kullanın ve açıkta kalan beyni ortaya çıkarın. NOT: Operasyon sırasında beyne herhangi bir zarar vermemek için dikkatli olun. Kemik parçalarını çıkarmadan önce, kafatasına yapışmış olabilecek meninksleri dikkatlice soyun. Bu önlem, işlem sırasında beyin dokusunun yanlışlıkla kesilmesini önlemek için çok önemlidir.</li>
	<li>Döner mikrotom kriyostatının gücünü açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve oda sıcaklığını -20 °C'ye ayarlayın. Numune diskinin yüzeyini eşit şekilde kaplamak için biraz OCT bileşiği dökün. Kriyo odasına yerleştirin ve OCT'nin katılaşmasına izin verin.</li>
	<li>Diski numune kafasına takın. Bıçağı bloğa yaklaştırın ve diske paralel düz bir düzlem oluşturmak için OCT bloğunu kesin.</li>
	<li>Beyni, bir tıraş bıçağı ile bir beyin dilimi kalıbında enjeksiyon bölgesinden uzakta koronal bir yönde kesin. Enjeksiyon bölgesini içeren beyin dokusunu, kesik tarafı aşağı bakacak şekilde OCT düz düzlemine yerleştirin.<ol><li>OCT'yi beynin üzerine dökün ve diski kriyo odasına koyun, böylece numune bloğunun katılaşmasına izin verin. Beyin OCT ile tamamen gömülü olana kadar OCT'yi tekrar tekrar beyne dökün. NOT: OCT bileşiğini katman katman ekleyin. Önceki OCT tabakası dondurulduktan sonra, sonraki OCT bileşiği tabakasını beynin üzerine dökün.</li>
	</ol></li>
	<li>Hedef bölge yaklaşana kadar numune bloğunu kesin. Enjeksiyon bölgesi seviyesinden birkaç bölüm yapın. Koronal beyin dilimlerini, -20 ° C'de tutulan küçük bir yazı fırçası kullanarak oda sıcaklığında PBS içeren 6 oyuklu bir plakaya toplayın. NOT: Bloğu kesmek için kesme kalınlığını daha büyük bir kalınlığa ayarlayın ve ardından bıçak enjeksiyon bölgesine yaklaşırken kesme kalınlığını 40 μm'ye ayarlayın. Nöral devre izleyicileri kullanılırsa, fareler hemen feda edilmez. Anesteziden kurtulmak için fareyi steril, ameliyat sonrası bir kurtarma kafesine bir ısıtma battaniyesi üzerine yerleştirin. Fareleri uyandıktan sonra orijinal kafese veya yeni bir kafese geri koyun.</li>
</ol>4. Görüntüleme
<ol><li>OCT'yi oda sıcaklığında PBS ile yıkayın. Beyin bölümlerini almak ve bir slayta yerleştirmek için bir fırça kullanın. Bölümlerin oda sıcaklığında kurumasına izin verin.</li>
	<li>Enjekte edilen bölgeyi görsel olarak gözlemleyin veya hedef çekirdekler çok küçük olduğunda mikroskop kullanın. Enjekte edilen boyanın yerini beyin atlasındaki ilgili bölge ile karşılaştırın. NOT: x, y ve z eksenlerinin değerlerini, enjeksiyon noktası sapmasının yönüne ve mesafesine göre ayarlayın. Koordinatları doğru bir şekilde belirlemek için bu protokoldeki tüm adımları birden çok kez tekrarlamak gerekebilir.</li>
</ol>

Farelerde Stereotaksik Mikroenjeksiyon Doğruluğunu Optimize Etme

<ol>
	<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor-mediated+projection-specific+regulation+of+depressive-like+and+nociceptive+behaviors+in+the+mesolimbic+reward+circuitry.">Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry.</a> Pain. 159 (1), 175 (2018).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+pain+relief+pathways+originating+from+primary+motor+cortex.">Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex.</a> Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).</li><li>Laing, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+hypothalamic+parvalbumin+neurons+are+glutamatergic+and+promote+escape+behavior.">Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior.</a> Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).</li><li>Perens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+3D+mouse+brain+atlas+framework+with+the+skull-derived+coordinate+system.">Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system.</a> Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).</li><li>Adhikari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basomedial+amygdala+mediates+top-down+control+of+anxiety+and+fear.">Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear.</a> Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).</li><li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+infralimbic+cortex+to+paraventricular+thalamus+mediate+fear+extinction+retrieval.">Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval.</a> Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).</li><li>Ansarifar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+volume+and+expression+time+in+an+aav-delivered+channelrhodopsin.">Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin.</a> Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).</li><li>Gonzalez, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+AAV+capsid+evolution+strategies+for+enhanced+CNS+gene+delivery.">Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+parallel+medial+prefrontal+cortex-amygdala+pathways+mediate+memory+deficits+via+glutamatergic+projection+in+surgery+mice.">Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice.</a> Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).</li><li>Koren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insular+cortex+neurons+encode+and+retrieve+specific+immune+responses.">Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses.</a> Cell. 184 (25), 6211 (2021).</li><li>Poller, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+motor+and+fear+circuits+regulate+leukocytes+during+acute+stress.">Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress.</a> Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+habenula+underlies+the+antidepressive+effects+of+light+therapy.">A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy.</a> Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+the+periaqueductal+gray+area+for+the+antinociceptive+effects+of+bright+light+treatment.">A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment.</a> Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+stepwise+tracing+of+polysynaptic+neuronal+circuits+with+replication-deficient+pseudorabies+virus.">Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus.</a> Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkar beyan etmezler.

Bu makale, stereotaksik beyin enjeksiyonlarının 5,6 doğruluğunu viral izlemeden önce daha hızlı ve basit bir şekilde doğrulamak için istikrarlı bir strateji tanımlamıştır, ancak beyin bölgesindeki raportör gen ekspresyonunun yeri doldurulamaz yönü, beyin bölgesi etiketlemesi için çok önemlidir. Kullandığımız mavi boya, enjeksiyon bölgesinin hemen görselleştirilmesine izin verdi.
Bu protokoldeki birkaç kri...

İn vivo kalsiyum kaydı, optogenetik ve kemogenetik araçlar dahil olmak üzere neredeyse tüm modern nöromodülasyon araçları, nöral manipülasyonun temelini oluşturan beyin ilgi alanını 1,2,3 hedeflemek için stereotaksik koordinatların kullanılmasını gerektirir. Fare beyin bölgeleri için stereotaksik koordinatlar, kafatası üzerindeki kemikli yer işaretleri olan bregma ve lambda ile ilişkili olarak tanımlanır ve kafatasından türetilmiş stereotaksik koordinat sistemini oluşturur. Ya bregma ya da lambda, üç boyutlu koordinatların sıfır noktası olarak hizmet edebilir. Üç eksen anteroposterior (AP), mediolateral (ML) ve dorsoventral (DV) olup, stereotaksik aletlerin dijital ekranında y, x ve z eksenlerini temsil eder. İyi bilinen beyin bölgeleri için, belirli bir alanın stereotaksik koordinat parametreleri, fare beyin atlaslarından4 (örneğin, stereotaksik koordinatlarda Paxinos ve Franklin'in fare beyni) ve/veya yayınlanmış literatürden 5,6 elde edilebilir. Bununla birlikte, stereotaksik ekipmandaki farklılıklar ve farklı araştırmacılar tarafından kullanılan farelerin yaşı / popülasyonları nedeniyle daha fazla doğrulama gereklidir.
Yapı, işlevin temelidir. Nöral devreler, bilişsel aktiviteler, duygu, hafıza, duyusal ve motor işlevler gibi birçok beyin fonksiyonunun temelini oluşturur1. Nöral devrelerin yapısını etiketlemek ve aktivitesini manipüle etmek, belirli bir nöral devrenin işlevini anlamak için hayati önem taşır. Geçtiğimiz on yıllar boyunca, nöral izleyiciler birçok nesil boyunca gelişti; erken araştırmalar, buğday tohumu aglütinini (WGA) ve phaseolus vulgaris aglütinini (PHA) anterograd izleyiciler olarak ve florogold (FG), kolera toksin alt birimi B (CTB), karbosiyanin retrograd izleyiciler olarak kabul edildi. Bununla birlikte, viral izleyicilerin aksine, bu geleneksel nöral izleyiciler, eksojen genleri konakçıya entegre edemezler ve hücre tipi seçiciliğine sahip değildirler. Günümüzde, viral strateji, temel sinirbilim araştırmaları sırasında önemli bir öneri haline gelmiştir. Farklı araştırma amaçları için çeşitli viral araçlar seçilebilir 7,8. Transsinaptik olmayan virüsler, trans-multisinaptik virüsler (retrograd ve anterograd) ve trans-monosinaptik virüsler (retrograd ve anterograd) vardır. Her kategori, ilgili özelliklere sahip birkaç tür içerir.
Viral uygulama ve ekspresyon süreci oldukça zaman ve kaynak yoğundur, genellikle haftalar veya daha uzun sürer. Çeşitli viral vektörler arasında, adeno-ilişkili virüs, deneysel prosedür için enjeksiyondan 3 ila 8 hafta sonra geniş bir pencere sağlayarak, gen iletimi için umut verici bir araç olarak tanımlanmıştır 7,8. AAV geliştikçe, uygulamadan 2-3 hafta sonra analiz yapılabilir 9,10. Yalancı kuduz virüsü (PRV) ve kuduz virüsü (RV) gibi diğer nöral devre izleyicileri de en az 2-7 günlük bir izleme süresi gerektirir 11,12,13,14,15. Bu nedenle, floresan sinyallerini gözlemlemeden önce enjeksiyon bölgesinin ön doğrulaması hem zaman hem de maliyet açısından etkilidir.
Stereotaksik enjeksiyonların basit ve hızlı bir şekilde doğrulanmasını kolaylaştırmak için, bu çalışmada, viral vektörlerden önce bir boya uygulanır ve kriyoseksiyon, araştırmacıların enjeksiyon bölgesini gözlemlemelerini ve enjeksiyondan sonraki 30 dakika içinde izlemelerini sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;L, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>65458-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-200-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3%H2O2 solution</td>
			<td>Lircon Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Shengyou Biotech</td>
			<td>20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anerdian</td>
			<td>Likang High-tech</td>
			<td>31001002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti roll plate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047742497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bend toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellsens dimension software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-Fluoromount-G</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Longxiang</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brushes</td>
			<td>HWAHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>y00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps straight with tooth</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J31010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion needle 0.7 mm</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine hydrochloride injection</td>
			<td>Harvest Pharmaceutical Company</td>
			<td>71230803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male C57/BL mice</td>
			<td>The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research&#8211;BK Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice coronal brain slice mold</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-02-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Cisen Pharmaceutical Company</td>
			<td>G23HDM9M4S5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piette 2-200 &#956;L</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>4642080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaving blades</td>
			<td>BFYING</td>
			<td>91560618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Citotest Scientific</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Holder</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>Aibei Biotechnology</td>
			<td>M2910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preliminary validation of stereotaxic injection coordinates via cryosectioning

Belirli bir beyin bölgesinin stereotaksik enjeksiyonu, temel sinirbilimde temel bir deneysel teknik oluşturur. Araştırmacılar genellikle stereotaksik enjeksiyon parametreleri seçimlerini fare beyin atlaslarına veya çeşitli popülasyonlar / yaşlarda fareler ve farklı stereotaksik ekipman kullanan yayınlanmış materyallere dayandırırlar ve bu da stereotaksik koordinat parametrelerinin daha fazla doğrulanmasını gerektirir. Kalsiyum görüntüleme, kemogenetik ve optogenetik manipülasyonların etkinliği, genellikle birkaç haftalık çaba gerektiren, ilgilenilen bölgedeki raportör genlerin kesin ifadesine dayanır. Bu nedenle, hedef beyin bölgesinin koordinatlarının önceden doğrulanmaması zaman alıcı bir iştir. Virüs yerine uygun bir boya kullanarak ve kriyoseksiyon uygulayarak, araştırmacılar boya uygulamasından hemen sonra enjeksiyon bölgesini gözlemleyebilirler. Bu, gerçek enjeksiyon bölgesi ile teorik konum arasında tutarsızlıkların olduğu durumlarda koordinat parametrelerinde zamanında ayarlamalar yapılmasını kolaylaştırır. Bu tür ayarlamalar, sonraki deneylerde hedef bölge içindeki viral ekspresyonun doğruluğunu önemli ölçüde artırır.

Nearly all modern neuromodulation tools, including in vivo calcium recording, optogenetic, and chemogenetic tools, require the use of stereotaxic coordinates to target the brain area of interest1,2,3, forming the foundation of neural manipulation. Stereotaxic coordinates for mouse brain regions are defined in relation to bregma and lambda, the bony landmarks on the cranium, forming the so-called skull-derived stereotaxic coordinate system. Either bregma or lambda can serve as the zero point of the three-dimensional coordinates. The three axes are anteroposterior (AP), mediolateral (ML), and dorsoventral (DV), representing the y, x, and z axes on the digital display of stereotaxic instruments. For well-known brain regions, the stereotaxic coordinate parameters of a specific area can be obtained from mouse brain atlases4 (e.g., Paxinos and Franklin&#39;s mouse brain in stereotaxic coordinates) and/or the published literature5,6. However, further validation is necessary due to variations in stereotaxic equipment and the age/populations of mice used by different researchers.
Structure is the basis of function. Neural circuits form the foundation for many brain functions, such as cognitive activities, emotion, memory, sensory, and motor functions1. Labeling the structure and manipulating the activity of neural circuits are vital for understanding the function of a specific neural circuit. Over the past decades, neural tracers have evolved through many generations; early research adopted wheat germ agglutinin (WGA) and phaseolus vulgaris agglutinin (PHA) as anterograde tracers, and fluorogold (FG), cholera toxin subunit B (CTB), carbocyanine as retrograde tracers. However, unlike viral tracers, these traditional neural tracers cannot integrate exogenous genes into the host, nor do they have cell type selectivity. Nowadays, the viral strategy has become an important proposition during basic neuroscience research. For different research purposes, various viral tools can be selected7,8. There are non-transsynaptic viruses, trans-multisynaptic viruses (retrograde and anterograde), and trans-monosynaptic viruses (retrograde and anterograde). Each category contains several types with respective characteristics.
The process of viral administration and expression is highly time- and resource-intensive, often taking weeks or even longer. Among various viral vectors, adeno-associated virus has been identified as a promising means for gene delivery, providing a wide window ranging from 3 to 8 weeks post-injection for the experimental procedure7,8. As AAV evolves, analysis can be performed 2-3 weeks after administration9,10. Other neural circuit tracers, such as pseudorabies virus (PRV) and rabies virus (RV), also require a tracing period of at least 2-7 days11,12,13,14,15. Thus, a preliminary verification of the injection site before observing fluorescence signals is both time- and cost-effective.
To facilitate a simple and rapid verification of stereotaxic injections, in this study, a dye is administered before viral vectors, and cryosectioning enables researchers to observe the injection site and track it within 30 min post-injection.

Yazar Spotlight: Stereotaksik Enjeksiyon ve Uygun Maliyetli Boyalar Yoluyla Farelerde Bilişsel Bozukluk Araştırmalarının Hızlandırılması

Kriyoseksiyon Yoluyla Stereotaksik Enjeksiyon Koordinatlarının Ön Doğrulaması

Bu çalışma, gösterilen yöntemi kullanarak enjeksiyon bölgesini 30 dakika içinde başarıyla tanımladı. Başlangıçta, bromofenol mavisi içeren bir SDS-PAGE numune yükleme çözeltisi, C57 / BL farelerinde LDTgV'ye enjekte edildi. Şekil 1A , boya çözeltisi enjeksiyonunun şematik bir gösterimini göstermektedir. LDTgV'deki mavi boyanın dağılımı Şekil 1B'de gösterilmiştir.
Bromofenol mavisi ayrıca bu protokolün...

Mevcut protokol, boyalar ve donmuş kesitler kullanarak viral izleme yapmadan önce stereotaksik enjeksiyon koordinatlarının doğrulama adımını hızlandırmak için pratik bir stratejiyi açıklamaktadır.

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

Araştırmamız öncelikle farelerde bilişsel bozukluğun altında yatan nöral devre mekanizmasını araştırmaya odaklanmaktadır. Ve bu çalışmalarda sıklıkla beyin stereotaksik tekniklerini kullanıyoruz. Amacımız, boyaların kullanıldığı stereotaksik enjeksiyon bölgeleri için doğrulama sürecini optimize etmek ve hızlandırmak, bunun basit ve hızlı bir prosedür haline gelmesini sağlamaktır.Virüsün stereotaksik enjeksiyonu yoluyla sinirbilim araştırmalarında çeşitli stratejiler çok önemli hale gelmiştir. Bunu, tamamlanması birkaç hafta süren bir süreç olan enjeksiyon bölgelerini doğrulamak için doku dilimindeki floresan belirteçlerin gözlemlenmesi takip eder. Protokolümüz, en az üç günlük dehidrasyon süresinden tasarruf ederek ve enjeksiyon bölgelerinin daha hızlı tanımlanması için uygun maliyetli bir boya kullanarak diğer tekniklere göre avantajlar sunar.Ön doğrulama olmamasına kıyasla haftalar kazandırabilir.

preliminary-validation-stereotaxic-injection-coordinates-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

885 Görüntüleme.  Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. Araştırmamız öncelikle farelerde bilişsel bozukluğun altında yatan nöral devre mekanizmasını araştırmaya odaklanmaktadır. Ve bu çalışmalarda sıklıkla beyin stereotaksik tekniklerini kullanıyoruz. Amacımız, boyaların kullanıldığı stereotaksik enjeksiyon bölgeleri için doğrulama sürecini optimize etmek ve hızlandırmak, bunun basit ve hızlı bir prosedür haline gelmesini sağlamaktır.Virüsün stereotaksik enjeksiyonu yoluyla sinirbilim araştırmaların...

Video: Yazar Spotlight: Stereotaksik Enjeksiyon ve Uygun Maliyetli Boyalar Yoluyla Farelerde Bilişsel Bozukluk Araştırmalarının Hızlandırılması

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their choice of stereotaxic injection parameters on mouse brain atlases or published materials that employed various populations/ages of mice and different stereotaxic equipment, necessitating further validation of the stereotaxic coordinate parameters. The efficacy of calcium imaging, chemogenetic, and optogenetic manipulations relies on the precise expression of reporter genes within the region of interest, often requiring several weeks of effort. Thus, it is a time-consuming task if the coordinates of the target brain region are not verified in advance. Using an appropriate dye instead of a virus and implementing cryosectioning, researchers can observe the injection site immediately following dye administration. This facilitates timely adjustments to coordinate parameters in cases where discrepancies exist between the actual injection site and the theoretical position. Such adjustments significantly enhance the accuracy of viral expression within the target region in subsequent experiments.

The present protocol describes a practical strategy to expedite the verification step of stereotaxic injection coordinates before conducting viral tracing using dyes and frozen sections.