هذه الطريقة الموفرة للوقت تقلل من التباين بين جولات من الإجراءات المناعية الكيميائية في دراسات علم الأعصاب لتحسين التصور التشريح والبروتينات المحلية والأنسجة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقلل من الوقت الذي استغرقه استئصال الكرب وتركيب أنسجة الدماغ من خلال الجمع بين أدمغة متعددة في كتلة واحدة مجمدة. في حين أن هذه التقنية هي الأمثل لأقسام الإكلال من أدمغة القوارض، فإنه يمكن تكييفها مع أقسام القوس أو عرضية أو أنواع مختلفة من الأنسجة مثل العضلات أو الكبد.
بعد الضخ عبر القلب الناجح ، بعد إصلاح الأدمغة من الحيوانات في قارورة 25 ملليلتر من 4 ٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، استخدم ملقط ًا مقلوبًا حادًا لإزالة الأدمغة من شبه شكلي. نقل الأدمغة إلى قارورة مع ما يقرب من 20 ملليلتر من محلول السكروز 30٪في TBS.
الحفاظ على العقول والحل حتى أنها تغرق في الجزء السفلي من القارورة. بعد ذلك، ضع كوب زجاجي 500 ملليلتر على سرير من الثلج الجاف في دلو الثلج. ثم صب 300 إلى 400 ملليلتر من إيسوبنتان في كوب.
الحفاظ على ال isopentane بين -45 و -50 درجة مئوية. على أعلى مقاعد البدلاء، وملء قالب التضمين المتاح تقريبا في منتصف الطريق كامل مع درجة حرارة القطع الأمثل أو مركب أكتوبر. استخدام إبرة لإزالة أي فقاعات الهواء من القالب.
استخدام ملقط مقلب حادة لإزالة الدماغ الأول من محلول السكروز. ثم استخدم شفرة حلاقة جديدة لإزالة المصابيح المخيخة والشمية قبل فصل نصفي الكرة الأرضية. بعد ذلك، إعطاء العقول نظام تسمية رقمية.
استخدام ملقط حادة، والتقاط الدماغ ليتم وضعها في موقف اثنين، وتوجيهه مع الجانب أن تقطع الأولى التي تواجه صعودا. خفض الدماغ في أكتوبر واستخدام ملاقط لضبط موقفها حتى يقف بشكل مستقل. تعديل رئيسي لهذه التقنية هو مساحة فارغة في موضع واحد.
تم تعيين هذه المساحة للسماح بسهولة تحديد اتجاه الكبراترا الكبيرة وبالتالي تحديد الحيوان المرتبط بكل دماغ. بعد كل من العقول قد وضعت في القالب، إضافة ما يكفي من أكتوبر لتغطية قمم العقول، ثم استخدام إبرة لإزالة أي فقاعات الهواء. عقد زاوية القالب مع ملقط ضمان لا تصبح ملقط مغمورة جزئيا في أكتوبر.
ثم، خفض القالب في isopentane بحيث يتم غمر الثلث السفلي من القالب. بعد 30 ثانية، خفض القالب بأكمله في isopentane والإفراج عنه من ملقط. بعد ثلاث دقائق، واستخدام ملقط لإزالة القالب من isopentane.
التفاف على الفور القالب ومحتوياته في رقائق الألومنيوم وتسمية ذلك بشكل مناسب. نقل ميجابراين إلى السلبية 20 درجة مئوية الفريزر لمدة لا تقل عن 24 ساعة. أولا، تعيين درجة حرارة مجلس الوزراء التبريد إلى درجة مئوية سلبية 19.
إزالة ميغابراين من الثلاجة ووضعها في التبريد. ثم وضع تشاك واثنين رقيقة يميل فرش الطلاء في التبريد. بعد ذلك، قم بتسمية الشرائح برقم تعريف ميغابراين ورقم الشريحة ووضع الشرائح على الشريحة الأكثر دفئاً.
بعد ذلك، فك مكبرات واستخدام شفرة حلاقة لقطع زوايا القالب. الاستغناء عن طبقة رقيقة من أكتوبر على تشاك. ثم ضع بسرعة megabrain على تشاك.
بعد يتم تجميد OCT تماما، وتطبيق طبقة ملليمترين من أكتوبر حول الجانبين من ميغابراين والسماح لها لتشغيل أسفل الجانبين على تشاك. استخدام شفرة حلاقة لإزالة أي أوك الزائدة من الجانبين وأسفل تشاك. أولا ، موقف تشاك شنت مع megabrain على رأس تشاك من cryostat.
ثم تعيين التبريد إلى سمك المطلوب. تقليم OCT والأنسجة حسب الحاجة للوصول إلى منطقة الدماغ المطلوبة لجمع الأنسجة. ثم خفض لوحة مكافحة لفة حتى يستريح على خشبة المسرح وتحويل مقبض التبريد لاتخاذ قسم واحد.
رفع ببطء قبالة لوحة مكافحة لفة، مع الحرص على أن لا يتم لمس قسم الأنسجة. استخدام بلطف فرش الطلاء لفك قسم الأنسجة حتى انها مسطحة الكذب. إذا لزم الأمر، عقد شقة OCT باستخدام فرش الطلاء لمنع المتداول.
ثم قم بإزالة الشريحة من الشريحة أكثر دفئًا ومرر مؤشرًا على جانب تسمية الشريحة لأسفل فوق قسم megabrain والسماح لها بالتمسك بالشريحة. تطبيق بسرعة قطرة من برنامج تلفزيوني إلى قسم الأنسجة. باستخدام فرشاة طلاء جيدة مقلوب انخفض في برنامج تلفزيوني، فرشاة من أي فقاعات في قسم الأنسجة وتتكشف الأنسجة بحيث يتم الكذب شقة على الشريحة.
وأخيراً، ضع الشريحة على الشريحة أكثر دفئًا لتجف لمدة 45 دقيقة واحفظ الشريحة عند درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية. في هذا البروتوكول، تم إعداد أنسجة الدماغ من تسعة والبكاء في وقت واحد. بعد القاء الكرياض، يمكن إجراء H & E تلطيخ من أصل لتقييم نوعية التبريد.
تظهر النتائج التمثيلية لجزيء محول الكالسيوم المتأين واحدًا أو Iba1 تلطيخ microglia تلطيخًا ثابتًا بين كل دماغ دراسة على ميغابراين واحد. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن ترصد باستمرار درجة الحرارة مع تجميد المكبر لمنع تكسير أو ذوبان ثم تجميد الأنسجة مما يؤدي إلى سلامة الأنسجة غير طبيعية. لا ينصح بفصل مجموعات العلاج المختلفة في كبرى مختلفة لأن هذا يمكن أن يخلق تباينا بين المجموعات أثناء التلطيخ والحد من التحيز والذاتية أثناء التصوير والتحليل.
لا ننسى أن العمل مع شبهformaldehyde يمكن أن تكون خطرة للغاية واحتياطات مثل ارتداء PBE والعمل في غطاء محرك السيارة ينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
