Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão nº 82101249 para XY Sun), Fundação de Pesquisa de Pós-Doutorado da China (concessão nº 2022M722125 para XY Sun). Programa de Vela de Xangai (concessão NO. 21YF1425100 para SH Chen). Projeto Especial de Pesquisa Clínica da Comissão Municipal de Saúde de Xangai (concessão Nº 202340088 a J Zhou). Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão Nº 82101262 a X Zhang, concessão Nº 82101287 a SH Chen).

Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) e o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Renji, Escola de Medicina da Universidade Jiaotong de Xangai. Camundongos machos C57BL/6J com oito semanas de idade foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) e alojados em gaiolas padrão (22 °C ± 2 °C, ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, alimentação e água ad libitum).
1. Seleção de regiões-alvo do cérebro
NOTA: Este é um procedimento estéril. Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos estejam esterilizados. Pulverize as luvas com álcool antes do contato com instrumentos cirúrgicos. Evite tocar na ponta dos instrumentos ou na área cirúrgica com luvas. Certifique-se de que o mouse esteja adequadamente anestesiado antes de iniciar o procedimento, verificando a perda dos reflexos de endireitamento e nenhuma resposta à estimulação cutânea. Antes da perfuração e injeção, monitore de perto a frequência respiratória (60-220 respirações por minuto, média de 100-150 respirações por minuto) e a amplitude respiratória (deve ser consistente e não excessivamente superficial ou profunda). Quaisquer alterações significativas na frequência ou amplitude respiratória devem ser observadas.
<ol><li>Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de tribromoetanol a 1,25% (250 mg / kg) usando uma agulha de 29 G. Raspe o cabelo do crânio assim que o reflexo de endireitamento desaparecer. Prenda o mouse na estrutura estereotáxica (consulte a Tabela de Materiais) fixando os incisivos superiores com uma pinça nasal e estabilizando a cabeça usando duas barras auriculares.</li>
	<li>Aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos. Desinfete o couro cabeludo esfregando-o três vezes com Anerdian (solução desinfetante; consulte a Tabela de Materiais). Injete 0,2 mL de lidocaína a 1% por via subcutânea usando uma agulha de insulina 29 G para fornecer analgesia local.</li>
	<li>Faça uma incisão de 0,5 cm usando uma tesoura de olho para expor o crânio. Utilize um cotonete embebido em 3% de H2O2 para esfregar o crânio exposto para remover o periósteo. Deixe o crânio secar.</li>
	<li>Fixe a broca no instrumento estereotáxico. Ajuste os botões dos braços estereotáxicos para posicionar a ponta da broca precisamente no bregma com a ajuda de uma lupa e registre o valor do eixo z usando o display digital LCD.<ol><li>Ajuste os botões e posicione a ponta da broca no lambda e registre o valor do eixo z. Ajuste o nariz clamp e as barras auriculares para aproximar dois valores z e repita as etapas acima até que a diferença entre os dois valores z seja inferior a 0.1 mm. NOTA: Os eixos x, y e z no display digital LCD correspondem a mediolateral (ML), anteroposterior (AP) e dorsoventral (DV), respectivamente. O bregma e o lambda podem ser considerados no mesmo plano horizontal, uma vez que a diferença entre os dois valores z é inferior a 0,1 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Garanta o nivelamento esquerda-direita do cérebro. Ajuste as barras auriculares fixadas à armação estereotáxica com a mesma escala. Veja o núcleo tegmental laterodorsal, parte ventral (LDTgV), por exemplo; suas coordenadas estereotáxicas são -5,2 para x, +0,8 para y, -4,0 para z, de acordo com o atlas do cérebro de camundongos de Paxinos e Franklin16.<ol><li>Ajuste a barra de orelha para fazer a broca em (-5,2, +0,8) para medir o valor z na direção dorsal-ventral e mova a broca para (-5,2, -0,8) para medir o valor z. NOTA: Considera-se que a esquerda-direita está no mesmo nível quando a diferença entre os dois valores z é inferior a 0,2 mm. As barras auriculares precisam ser inseridas no lugar certo porque o conduto auditivo externo é simétrico. Se a diferença entre os dois valores z for superior a 0,5 mm, a barra auricular pode ser inserida no lugar errado.</li>
	</ol></li>
	<li>Posicione a broca no bregma novamente e defina três coordenadas no display digital LCD para zero. Posicione a broca acima da região de interesse usando coordenadas de referência. Comece a broca.<ol><li>Abaixe gradualmente a broca usando o braço vertical até que ela penetre no crânio. Limpe os detritos e o sangue usando cotonetes. NOTA: Tenha cuidado para não danificar o tecido cerebral.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação da solução de corante e microinjeção cerebral
<ol><li>Pegue 25 μL de tampão de carregamento SDS-PAGE contendo azul de bromofenol (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo de microcentrífuga de 200 μL. Adicione 50 μL de ddH2O ao tubo para preparar a solução de corante.</li>
	<li>Cubra a janela craniana com um algodão umedecido com solução salina. Garanta a permeabilidade da microsseringa aspirando e expelindo solução salina repetidamente. Coloque 0,3 μL de corante na micro seringa. Conecte a seringa e o microinjetor estereotáxico motorizado ao braço estereotáxico.</li>
	<li>Posicione a ponta da seringa no bregma e defina as coordenadas para zero no display digital LCD. Ajuste a agulha na região de interesse de acordo com as coordenadas de referência. Defina a velocidade de injeção para 0,1 μL/min e inicie o microinjetor motorizado, fornecendo 0,3 μL de corante azul na região alvo. Deixe a seringa na posição por pelo menos 10 minutos antes de retirar lentamente o injetor. NOTA: Corantes de cores diferentes podem ser usados nos mesmos mouses para distinguir regiões próximas. Teste outros corantes para concentrações adequadas com base em suas propriedades físicas. Recomenda-se usar a fórmula azul de bromofenol e enxaguar bem a seringa antes e depois do uso para evitar bloqueios. Ajuste os volumes de injeção com base na difusão do corante.</li>
</ol>3. Colheita de tecido cerebral e criossecção
<ol><li>Solte o mouse do quadro estereotáxico. Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de 50 mg / kg de pentobarbital sódico usando uma agulha de 29 G. Prenda o mouse em uma placa de espuma com fita adesiva.</li>
	<li>Abra os dois lados do tórax para induzir asfixia rápida. Faça uma incisão de 1-2 mm no apêndice atrial direito. Insira uma agulha de perfusão no ventrículo esquerdo. Infundir 20 mL de solução salina pré-resfriada e 20 mL de solução gelada de paraformaldeído a 4%.</li>
	<li>Decapite o camundongo com uma tesoura de dissecação de tecidos (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Remova a pele fazendo uma incisão ao longo da linha média do pescoço ao nariz e, em seguida, exponha o crânio. Limpe o músculo residual do crânio com uma pinça ou tesoura.</li>
	<li>Posicione a ponta de uma lâmina da tesoura fina entre o forame magno e o cérebro, com a borda afiada voltada para o osso, na extremidade rostral da sutura sagital média. Prossiga para deslizar e cortar o crânio ao longo da sutura sagital média. Empregue fórceps para remover o crânio, revelando o cérebro exposto. NOTA: Tenha cuidado para evitar causar danos ao cérebro durante a operação. Antes de remover as lascas ósseas, retire cuidadosamente quaisquer meninges que possam estar presas ao crânio. Essa precaução é crucial para evitar o corte inadvertido do tecido cerebral durante o processo.</li>
	<li>Ligue a alimentação do criostato de micrótomo rotativo (consulte a Tabela de Materiais) e ajuste a temperatura da câmara para -20 °C. Despeje um pouco de composto OCT para cobrir a superfície do disco de amostra uniformemente. Coloque-o na câmara criogênica e deixe o OCT solidificar.</li>
	<li>Fixe o disco à cabeça da amostra. Aproxime a lâmina do bloco e apare o bloco OCT para fazer um plano plano paralelo ao disco.</li>
	<li>Corte o cérebro em uma direção coronal longe do local da injeção em um molde de fatia de cérebro por uma lâmina de barbear. Coloque o tecido cerebral que contém o local da injeção com o lado cortado voltado para baixo no plano plano da OCT.<ol><li>Despeje OCT no cérebro e coloque o disco na câmara criogênica, permitindo que o bloco de amostra se solidifique. Despeje OCT repetidamente no cérebro até que o cérebro esteja totalmente incorporado ao OCT. NOTA: Adicione o composto OCT camada por camada. Uma vez que a camada anterior de OCT esteja congelada, despeje a camada subsequente de composto de OCT no cérebro.</li>
	</ol></li>
	<li>Apare o bloco de amostra até que a região alvo se aproxime. Faça várias seções a partir do nível do local de injeção. Colete as fatias do cérebro coronal em uma placa de 6 poços contendo PBS em temperatura ambiente usando um pequeno pincel de escrita mantido a -20 ° C. NOTA: Defina a espessura de corte para uma maior para aparar o bloco e, em seguida, defina a espessura de corte para 40 μm à medida que a lâmina se aproxima do local de injeção. Se forem usados traçadores de circuitos neurais, os camundongos não serão sacrificados imediatamente. Coloque o camundongo em uma gaiola de recuperação pós-operatória estéril sobre um cobertor de aquecimento para recuperação da anestesia. Retorne os ratos para a gaiola original ou para uma nova gaiola quando estiverem acordados.</li>
</ol>4. Exames por imagem
<ol><li>Lave a OCT com PBS em temperatura ambiente. Use um pincel para pegar seções do cérebro e colocá-las em um slide. Deixe as seções secarem ao ar livre em temperatura ambiente.</li>
	<li>Observe a região injetada visualmente ou use um microscópio quando os núcleos alvo forem minúsculos. Compare a localização do corante injetado com a região correspondente no atlas cerebral. NOTA: Ajuste os valores dos eixos x, y e z de acordo com a direção e a distância do desvio do ponto de injeção. Pode ser necessário repetir todas as etapas deste protocolo várias vezes para determinar as coordenadas com precisão.</li>
</ol>

Otimizando a precisão da microinjeção estereotáxica em camundongos

<ol>
	<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor-mediated+projection-specific+regulation+of+depressive-like+and+nociceptive+behaviors+in+the+mesolimbic+reward+circuitry.">Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry.</a> Pain. 159 (1), 175 (2018).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+pain+relief+pathways+originating+from+primary+motor+cortex.">Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex.</a> Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).</li><li>Laing, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+hypothalamic+parvalbumin+neurons+are+glutamatergic+and+promote+escape+behavior.">Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior.</a> Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).</li><li>Perens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+3D+mouse+brain+atlas+framework+with+the+skull-derived+coordinate+system.">Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system.</a> Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).</li><li>Adhikari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basomedial+amygdala+mediates+top-down+control+of+anxiety+and+fear.">Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear.</a> Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).</li><li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+infralimbic+cortex+to+paraventricular+thalamus+mediate+fear+extinction+retrieval.">Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval.</a> Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).</li><li>Ansarifar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+volume+and+expression+time+in+an+aav-delivered+channelrhodopsin.">Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin.</a> Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).</li><li>Gonzalez, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+AAV+capsid+evolution+strategies+for+enhanced+CNS+gene+delivery.">Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+parallel+medial+prefrontal+cortex-amygdala+pathways+mediate+memory+deficits+via+glutamatergic+projection+in+surgery+mice.">Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice.</a> Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).</li><li>Koren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insular+cortex+neurons+encode+and+retrieve+specific+immune+responses.">Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses.</a> Cell. 184 (25), 6211 (2021).</li><li>Poller, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+motor+and+fear+circuits+regulate+leukocytes+during+acute+stress.">Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress.</a> Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+habenula+underlies+the+antidepressive+effects+of+light+therapy.">A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy.</a> Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+the+periaqueductal+gray+area+for+the+antinociceptive+effects+of+bright+light+treatment.">A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment.</a> Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+stepwise+tracing+of+polysynaptic+neuronal+circuits+with+replication-deficient+pseudorabies+virus.">Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus.</a> Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Este artigo descreveu uma estratégia estável para verificar a precisão das injeções cerebrais estereotáxicas 5,6 mais rápida e simplesmente antes do rastreamento viral, mas o aspecto insubstituível da expressão do gene repórter na região do cérebro é crucial para a rotulagem da região cerebral. O corante azul que usamos permitiu a visualização imediata do local da injeção.
Várias etapas críticas neste protocolo cont...

Quase todas as ferramentas modernas de neuromodulação, incluindo registro de cálcio in vivo, ferramentas optogenéticas e quimiogenéticas, requerem o uso de coordenadas estereotáxicas para atingir a área de interesse do cérebro 1,2,3, formando a base da manipulação neural. As coordenadas estereotáxicas para as regiões do cérebro de camundongos são definidas em relação ao bregma e lambda, os marcos ósseos no crânio, formando o chamado sistema de coordenadas estereotáxicas derivado do crânio. Bregma ou lambda podem servir como o ponto zero das coordenadas tridimensionais. Os três eixos são ântero-posterior (AP), mediolateral (ML) e dorsoventral (DV), representando os eixos y, x e z no display digital de instrumentos estereotáxicos. Para regiões cerebrais bem conhecidas, os parâmetros de coordenadas estereotáxicas de uma área específica podem ser obtidos a partir de atlas cerebrais de camundongos4 (por exemplo, cérebro de camundongo de Paxinos e Franklin em coordenadas estereotáxicas) e / ou da literatura publicada 5,6. No entanto, uma validação adicional é necessária devido a variações no equipamento estereotáxico e na idade/populações de camundongos usados por diferentes pesquisadores.
A estrutura é a base da função. Os circuitos neurais formam a base para muitas funções cerebrais, como atividades cognitivas, emoções, memória, funções sensoriais e motoras1. Rotular a estrutura e manipular a atividade dos circuitos neurais são vitais para entender a função de um circuito neural específico. Nas últimas décadas, os traçadores neurais evoluíram ao longo de muitas gerações; pesquisas iniciais adotaram aglutinina de gérmen de trigo (WGA) e aglutinina phaseolus vulgaris (PHA) como traçadores anterógrados, e fluoroouro (FG), subunidade B da toxina da cólera (CTB), carbocianina como traçadores retrógrados. No entanto, ao contrário dos marcadores virais, esses traçadores neurais tradicionais não podem integrar genes exógenos ao hospedeiro, nem têm seletividade de tipo de célula. Atualmente, a estratégia viral tornou-se uma proposta importante durante a pesquisa básica em neurociência. Para diferentes fins de pesquisa, várias ferramentas virais podem ser selecionadas 7,8. Existem vírus não transsinápticos, vírus transmultissinápticos (retrógrados e anterógrados) e vírus transmonossinápticos (retrógrados e anterógrados). Cada categoria contém vários tipos com as respectivas características.
O processo de administração e expressão viral é altamente demorado e intensivo em recursos, muitas vezes levando semanas ou até mais. Dentre os vários vetores virais, o vírus adeno-associado tem sido identificado como um meio promissor para a entrega de genes, proporcionando uma ampla janela que varia de 3 a 8 semanas pós-injeção para o procedimento experimental 7,8. À medida que a VAA evolui, a análise pode ser realizada 2-3 semanas após a administração 9,10. Outros traçadores de circuitos neurais, como o vírus da pseudo-raiva (PRV) e o vírus da raiva (RV), também requerem um período de rastreamento de pelo menos 2-7 dias 11,12,13,14,15. Assim, uma verificação preliminar do local da injeção antes de observar os sinais de fluorescência é eficaz em termos de tempo e custo.
Para facilitar uma verificação simples e rápida das injeções estereotáxicas, neste estudo, um corante é administrado antes dos vetores virais, e a criossecção permite que os pesquisadores observem o local da injeção e o rastreiem dentro de 30 minutos após a injeção.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;L, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>65458-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-200-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3%H2O2 solution</td>
			<td>Lircon Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Shengyou Biotech</td>
			<td>20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anerdian</td>
			<td>Likang High-tech</td>
			<td>31001002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti roll plate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047742497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bend toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellsens dimension software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-Fluoromount-G</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Longxiang</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brushes</td>
			<td>HWAHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>y00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps straight with tooth</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J31010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion needle 0.7 mm</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine hydrochloride injection</td>
			<td>Harvest Pharmaceutical Company</td>
			<td>71230803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male C57/BL mice</td>
			<td>The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research&#8211;BK Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice coronal brain slice mold</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-02-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Cisen Pharmaceutical Company</td>
			<td>G23HDM9M4S5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piette 2-200 &#956;L</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>4642080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaving blades</td>
			<td>BFYING</td>
			<td>91560618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Citotest Scientific</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Holder</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>Aibei Biotechnology</td>
			<td>M2910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preliminary validation of stereotaxic injection coordinates via cryosectioning

A injeção estereotáxica de uma região específica do cérebro constitui uma técnica experimental fundamental na neurociência básica. Os pesquisadores geralmente baseiam sua escolha de parâmetros de injeção estereotáxica em atlas cerebrais de camundongos ou materiais publicados que empregaram várias populações/idades de camundongos e diferentes equipamentos estereotáxicos, necessitando de validação adicional dos parâmetros de coordenadas estereotáxicas. A eficácia das manipulações de imagens de cálcio, quimiogenéticas e optogenéticas depende da expressão precisa de genes repórteres dentro da região de interesse, muitas vezes exigindo várias semanas de esforço. Assim, é uma tarefa demorada se as coordenadas da região alvo do cérebro não forem verificadas com antecedência. Usando um corante apropriado em vez de um vírus e implementando a criossecção, os pesquisadores podem observar o local da injeção imediatamente após a administração do corante. Isso facilita ajustes oportunos para coordenar os parâmetros nos casos em que existem discrepâncias entre o local real da injeção e a posição teórica. Tais ajustes aumentam significativamente a precisão da expressão viral dentro da região-alvo em experimentos subsequentes.

Nearly all modern neuromodulation tools, including in vivo calcium recording, optogenetic, and chemogenetic tools, require the use of stereotaxic coordinates to target the brain area of interest1,2,3, forming the foundation of neural manipulation. Stereotaxic coordinates for mouse brain regions are defined in relation to bregma and lambda, the bony landmarks on the cranium, forming the so-called skull-derived stereotaxic coordinate system. Either bregma or lambda can serve as the zero point of the three-dimensional coordinates. The three axes are anteroposterior (AP), mediolateral (ML), and dorsoventral (DV), representing the y, x, and z axes on the digital display of stereotaxic instruments. For well-known brain regions, the stereotaxic coordinate parameters of a specific area can be obtained from mouse brain atlases4 (e.g., Paxinos and Franklin&#39;s mouse brain in stereotaxic coordinates) and/or the published literature5,6. However, further validation is necessary due to variations in stereotaxic equipment and the age/populations of mice used by different researchers.
Structure is the basis of function. Neural circuits form the foundation for many brain functions, such as cognitive activities, emotion, memory, sensory, and motor functions1. Labeling the structure and manipulating the activity of neural circuits are vital for understanding the function of a specific neural circuit. Over the past decades, neural tracers have evolved through many generations; early research adopted wheat germ agglutinin (WGA) and phaseolus vulgaris agglutinin (PHA) as anterograde tracers, and fluorogold (FG), cholera toxin subunit B (CTB), carbocyanine as retrograde tracers. However, unlike viral tracers, these traditional neural tracers cannot integrate exogenous genes into the host, nor do they have cell type selectivity. Nowadays, the viral strategy has become an important proposition during basic neuroscience research. For different research purposes, various viral tools can be selected7,8. There are non-transsynaptic viruses, trans-multisynaptic viruses (retrograde and anterograde), and trans-monosynaptic viruses (retrograde and anterograde). Each category contains several types with respective characteristics.
The process of viral administration and expression is highly time- and resource-intensive, often taking weeks or even longer. Among various viral vectors, adeno-associated virus has been identified as a promising means for gene delivery, providing a wide window ranging from 3 to 8 weeks post-injection for the experimental procedure7,8. As AAV evolves, analysis can be performed 2-3 weeks after administration9,10. Other neural circuit tracers, such as pseudorabies virus (PRV) and rabies virus (RV), also require a tracing period of at least 2-7 days11,12,13,14,15. Thus, a preliminary verification of the injection site before observing fluorescence signals is both time- and cost-effective.
To facilitate a simple and rapid verification of stereotaxic injections, in this study, a dye is administered before viral vectors, and cryosectioning enables researchers to observe the injection site and track it within 30 min post-injection.

Autor em destaque: Acelerando a pesquisa de comprometimento cognitivo em camundongos por meio de injeção estereotáxica e corantes econômicos

Validação preliminar de coordenadas de injeção estereotáxica via crioseccionamento

Our research primarily focus on investigating the neural circuits mechanism underlying cognitive impairment in mice. And we frequently employ brain stereotaxic techniques in these studies. Our objective is to optimize and accelerate the verification process for stereotaxic injection sites using dyes, ensuring that it becomes a simple and rapid procedure.Various strategies have become crucial in neuroscience research through stereotaxic injection of virus. This is followed by observation of fluorescent markers in tissue slice to confirm the injection sites, a process that takes several weeks to complete. Our protocol offers advantages over other techniques by saving at least three days of dehydration time and using a cost-effective dye for quicker identification of injection sites.It may save weeks compared with no preliminary verification.

Este estudo identificou com sucesso o local da injeção em 30 minutos usando o método demonstrado. Inicialmente, uma solução de carregamento de amostra SDS-PAGE contendo azul de bromofenol foi injetada no LDTgV nos camundongos C57 / BL. A Figura 1A mostra uma representação esquemática da injeção da solução de corante. A distribuição do corante azul no LDTgV é ilustrada na Figura 1B.
O azul de bromofenol também foi injet...

O presente protocolo descreve uma estratégia prática para agilizar a etapa de verificação das coordenadas de injeção estereotáxica antes de realizar o rastreamento viral usando corantes e seções congeladas.

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

Nossa pesquisa se concentra principalmente em investigar o mecanismo dos circuitos neurais subjacentes ao comprometimento cognitivo em camundongos. E frequentemente empregamos técnicas estereotáxicas cerebrais nesses estudos. Nosso objetivo é otimizar e acelerar o processo de verificação de locais de injeção estereotáxica usando corantes, garantindo que se torne um procedimento simples e rápido.Várias estratégias tornaram-se cruciais na pesquisa em neurociência por meio da injeção estereotáxica de vírus. Isso é seguido pela observação de marcadores fluorescentes na fatia de tecido para confirmar os locais de injeção, um processo que leva várias semanas para ser concluído. Nosso protocolo oferece vantagens sobre outras técnicas, economizando pelo menos três dias de tempo de desidratação e usando um corante econômico para identificação mais rápida dos locais de injeção.Pode economizar semanas em comparação com nenhuma verificação preliminar.

preliminary-validation-stereotaxic-injection-coordinates-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

804 visualizações.  Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. Nossa pesquisa se concentra principalmente em investigar o mecanismo dos circuitos neurais subjacentes ao comprometimento cognitivo em camundongos. E frequentemente empregamos técnicas estereotáxicas cerebrais nesses estudos. Nosso objetivo é otimizar e acelerar o processo de verificação de locais de injeção estereotáxica usando corantes, garantindo que se torne um procedimento simples e rápido.Várias estratégias tornaram-se cruciais na pesquisa em neurociência por meio da ...