Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão nº 82101249 para XY Sun), Fundação de Pesquisa de Pós-Doutorado da China (concessão nº 2022M722125 para XY Sun). Programa de Vela de Xangai (concessão NO. 21YF1425100 para SH Chen). Projeto Especial de Pesquisa Clínica da Comissão Municipal de Saúde de Xangai (concessão Nº 202340088 a J Zhou). Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão Nº 82101262 a X Zhang, concessão Nº 82101287 a SH Chen).

Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) e o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Renji, Escola de Medicina da Universidade Jiaotong de Xangai. Camundongos machos C57BL/6J com oito semanas de idade foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) e alojados em gaiolas padrão (22 °C ± 2 °C, ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, alimentação e água ad libitum).
1. Seleção de regiões-alvo do cérebro
NOTA: Este é um procedimento estéril. Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos estejam esterilizados. Pulverize as luvas com álcool antes do contato com instrumentos cirúrgicos. Evite tocar na ponta dos instrumentos ou na área cirúrgica com luvas. Certifique-se de que o mouse esteja adequadamente anestesiado antes de iniciar o procedimento, verificando a perda dos reflexos de endireitamento e nenhuma resposta à estimulação cutânea. Antes da perfuração e injeção, monitore de perto a frequência respiratória (60-220 respirações por minuto, média de 100-150 respirações por minuto) e a amplitude respiratória (deve ser consistente e não excessivamente superficial ou profunda). Quaisquer alterações significativas na frequência ou amplitude respiratória devem ser observadas.
<ol><li>Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de tribromoetanol a 1,25% (250 mg / kg) usando uma agulha de 29 G. Raspe o cabelo do crânio assim que o reflexo de endireitamento desaparecer. Prenda o mouse na estrutura estereotáxica (consulte a Tabela de Materiais) fixando os incisivos superiores com uma pinça nasal e estabilizando a cabeça usando duas barras auriculares.</li>
	<li>Aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos. Desinfete o couro cabeludo esfregando-o três vezes com Anerdian (solução desinfetante; consulte a Tabela de Materiais). Injete 0,2 mL de lidocaína a 1% por via subcutânea usando uma agulha de insulina 29 G para fornecer analgesia local.</li>
	<li>Faça uma incisão de 0,5 cm usando uma tesoura de olho para expor o crânio. Utilize um cotonete embebido em 3% de H2O2 para esfregar o crânio exposto para remover o periósteo. Deixe o crânio secar.</li>
	<li>Fixe a broca no instrumento estereotáxico. Ajuste os botões dos braços estereotáxicos para posicionar a ponta da broca precisamente no bregma com a ajuda de uma lupa e registre o valor do eixo z usando o display digital LCD.<ol><li>Ajuste os botões e posicione a ponta da broca no lambda e registre o valor do eixo z. Ajuste o nariz clamp e as barras auriculares para aproximar dois valores z e repita as etapas acima até que a diferença entre os dois valores z seja inferior a 0.1 mm. NOTA: Os eixos x, y e z no display digital LCD correspondem a mediolateral (ML), anteroposterior (AP) e dorsoventral (DV), respectivamente. O bregma e o lambda podem ser considerados no mesmo plano horizontal, uma vez que a diferença entre os dois valores z é inferior a 0,1 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Garanta o nivelamento esquerda-direita do cérebro. Ajuste as barras auriculares fixadas à armação estereotáxica com a mesma escala. Veja o núcleo tegmental laterodorsal, parte ventral (LDTgV), por exemplo; suas coordenadas estereotáxicas são -5,2 para x, +0,8 para y, -4,0 para z, de acordo com o atlas do cérebro de camundongos de Paxinos e Franklin16.<ol><li>Ajuste a barra de orelha para fazer a broca em (-5,2, +0,8) para medir o valor z na direção dorsal-ventral e mova a broca para (-5,2, -0,8) para medir o valor z. NOTA: Considera-se que a esquerda-direita está no mesmo nível quando a diferença entre os dois valores z é inferior a 0,2 mm. As barras auriculares precisam ser inseridas no lugar certo porque o conduto auditivo externo é simétrico. Se a diferença entre os dois valores z for superior a 0,5 mm, a barra auricular pode ser inserida no lugar errado.</li>
	</ol></li>
	<li>Posicione a broca no bregma novamente e defina três coordenadas no display digital LCD para zero. Posicione a broca acima da região de interesse usando coordenadas de referência. Comece a broca.<ol><li>Abaixe gradualmente a broca usando o braço vertical até que ela penetre no crânio. Limpe os detritos e o sangue usando cotonetes. NOTA: Tenha cuidado para não danificar o tecido cerebral.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação da solução de corante e microinjeção cerebral
<ol><li>Pegue 25 μL de tampão de carregamento SDS-PAGE contendo azul de bromofenol (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo de microcentrífuga de 200 μL. Adicione 50 μL de ddH2O ao tubo para preparar a solução de corante.</li>
	<li>Cubra a janela craniana com um algodão umedecido com solução salina. Garanta a permeabilidade da microsseringa aspirando e expelindo solução salina repetidamente. Coloque 0,3 μL de corante na micro seringa. Conecte a seringa e o microinjetor estereotáxico motorizado ao braço estereotáxico.</li>
	<li>Posicione a ponta da seringa no bregma e defina as coordenadas para zero no display digital LCD. Ajuste a agulha na região de interesse de acordo com as coordenadas de referência. Defina a velocidade de injeção para 0,1 μL/min e inicie o microinjetor motorizado, fornecendo 0,3 μL de corante azul na região alvo. Deixe a seringa na posição por pelo menos 10 minutos antes de retirar lentamente o injetor. NOTA: Corantes de cores diferentes podem ser usados nos mesmos mouses para distinguir regiões próximas. Teste outros corantes para concentrações adequadas com base em suas propriedades físicas. Recomenda-se usar a fórmula azul de bromofenol e enxaguar bem a seringa antes e depois do uso para evitar bloqueios. Ajuste os volumes de injeção com base na difusão do corante.</li>
</ol>3. Colheita de tecido cerebral e criossecção
<ol><li>Solte o mouse do quadro estereotáxico. Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de 50 mg / kg de pentobarbital sódico usando uma agulha de 29 G. Prenda o mouse em uma placa de espuma com fita adesiva.</li>
	<li>Abra os dois lados do tórax para induzir asfixia rápida. Faça uma incisão de 1-2 mm no apêndice atrial direito. Insira uma agulha de perfusão no ventrículo esquerdo. Infundir 20 mL de solução salina pré-resfriada e 20 mL de solução gelada de paraformaldeído a 4%.</li>
	<li>Decapite o camundongo com uma tesoura de dissecação de tecidos (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Remova a pele fazendo uma incisão ao longo da linha média do pescoço ao nariz e, em seguida, exponha o crânio. Limpe o músculo residual do crânio com uma pinça ou tesoura.</li>
	<li>Posicione a ponta de uma lâmina da tesoura fina entre o forame magno e o cérebro, com a borda afiada voltada para o osso, na extremidade rostral da sutura sagital média. Prossiga para deslizar e cortar o crânio ao longo da sutura sagital média. Empregue fórceps para remover o crânio, revelando o cérebro exposto. NOTA: Tenha cuidado para evitar causar danos ao cérebro durante a operação. Antes de remover as lascas ósseas, retire cuidadosamente quaisquer meninges que possam estar presas ao crânio. Essa precaução é crucial para evitar o corte inadvertido do tecido cerebral durante o processo.</li>
	<li>Ligue a alimentação do criostato de micrótomo rotativo (consulte a Tabela de Materiais) e ajuste a temperatura da câmara para -20 °C. Despeje um pouco de composto OCT para cobrir a superfície do disco de amostra uniformemente. Coloque-o na câmara criogênica e deixe o OCT solidificar.</li>
	<li>Fixe o disco à cabeça da amostra. Aproxime a lâmina do bloco e apare o bloco OCT para fazer um plano plano paralelo ao disco.</li>
	<li>Corte o cérebro em uma direção coronal longe do local da injeção em um molde de fatia de cérebro por uma lâmina de barbear. Coloque o tecido cerebral que contém o local da injeção com o lado cortado voltado para baixo no plano plano da OCT.<ol><li>Despeje OCT no cérebro e coloque o disco na câmara criogênica, permitindo que o bloco de amostra se solidifique. Despeje OCT repetidamente no cérebro até que o cérebro esteja totalmente incorporado ao OCT. NOTA: Adicione o composto OCT camada por camada. Uma vez que a camada anterior de OCT esteja congelada, despeje a camada subsequente de composto de OCT no cérebro.</li>
	</ol></li>
	<li>Apare o bloco de amostra até que a região alvo se aproxime. Faça várias seções a partir do nível do local de injeção. Colete as fatias do cérebro coronal em uma placa de 6 poços contendo PBS em temperatura ambiente usando um pequeno pincel de escrita mantido a -20 ° C. NOTA: Defina a espessura de corte para uma maior para aparar o bloco e, em seguida, defina a espessura de corte para 40 μm à medida que a lâmina se aproxima do local de injeção. Se forem usados traçadores de circuitos neurais, os camundongos não serão sacrificados imediatamente. Coloque o camundongo em uma gaiola de recuperação pós-operatória estéril sobre um cobertor de aquecimento para recuperação da anestesia. Retorne os ratos para a gaiola original ou para uma nova gaiola quando estiverem acordados.</li>
</ol>4. Exames por imagem
<ol><li>Lave a OCT com PBS em temperatura ambiente. Use um pincel para pegar seções do cérebro e colocá-las em um slide. Deixe as seções secarem ao ar livre em temperatura ambiente.</li>
	<li>Observe a região injetada visualmente ou use um microscópio quando os núcleos alvo forem minúsculos. Compare a localização do corante injetado com a região correspondente no atlas cerebral. NOTA: Ajuste os valores dos eixos x, y e z de acordo com a direção e a distância do desvio do ponto de injeção. Pode ser necessário repetir todas as etapas deste protocolo várias vezes para determinar as coordenadas com precisão.</li>
</ol>

Otimizando a precisão da microinjeção estereotáxica em camundongos

<ol>
	<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor-mediated+projection-specific+regulation+of+depressive-like+and+nociceptive+behaviors+in+the+mesolimbic+reward+circuitry.">Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry.</a> Pain. 159 (1), 175 (2018).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+pain+relief+pathways+originating+from+primary+motor+cortex.">Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex.</a> Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).</li><li>Laing, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+hypothalamic+parvalbumin+neurons+are+glutamatergic+and+promote+escape+behavior.">Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior.</a> Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).</li><li>Perens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+3D+mouse+brain+atlas+framework+with+the+skull-derived+coordinate+system.">Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system.</a> Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).</li><li>Adhikari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basomedial+amygdala+mediates+top-down+control+of+anxiety+and+fear.">Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear.</a> Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).</li><li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+infralimbic+cortex+to+paraventricular+thalamus+mediate+fear+extinction+retrieval.">Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval.</a> Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).</li><li>Ansarifar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+volume+and+expression+time+in+an+aav-delivered+channelrhodopsin.">Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin.</a> Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).</li><li>Gonzalez, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+AAV+capsid+evolution+strategies+for+enhanced+CNS+gene+delivery.">Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+parallel+medial+prefrontal+cortex-amygdala+pathways+mediate+memory+deficits+via+glutamatergic+projection+in+surgery+mice.">Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice.</a> Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).</li><li>Koren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insular+cortex+neurons+encode+and+retrieve+specific+immune+responses.">Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses.</a> Cell. 184 (25), 6211 (2021).</li><li>Poller, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+motor+and+fear+circuits+regulate+leukocytes+during+acute+stress.">Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress.</a> Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+habenula+underlies+the+antidepressive+effects+of+light+therapy.">A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy.</a> Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+the+periaqueductal+gray+area+for+the+antinociceptive+effects+of+bright+light+treatment.">A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment.</a> Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+stepwise+tracing+of+polysynaptic+neuronal+circuits+with+replication-deficient+pseudorabies+virus.">Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus.</a> Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Este artigo descreveu uma estratégia estável para verificar a precisão das injeções cerebrais estereotáxicas 5,6 mais rápida e simplesmente antes do rastreamento viral, mas o aspecto insubstituível da expressão do gene repórter na região do cérebro é crucial para a rotulagem da região cerebral. O corante azul que usamos permitiu a visualização imediata do local da injeção.
Várias etapas críticas neste protocolo cont...

Quase todas as ferramentas modernas de neuromodulação, incluindo registro de cálcio in vivo, ferramentas optogenéticas e quimiogenéticas, requerem o uso de coordenadas estereotáxicas para atingir a área de interesse do cérebro 1,2,3, formando a base da manipulação neural. As coordenadas estereotáxicas para as regiões do cérebro de camundongos são definidas em relação ao bregma e lambda, os marcos ósseos no crânio, formando o chamado sistema de coordenadas estereotáxicas derivado do crânio. Bregma ou lambda podem servir como o ponto zero das coordenadas tridimensionais. Os três eixos são ântero-posterior (AP), mediolateral (ML) e dorsoventral (DV), representando os eixos y, x e z no display digital de instrumentos estereotáxicos. Para regiões cerebrais bem conhecidas, os parâmetros de coordenadas estereotáxicas de uma área específica podem ser obtidos a partir de atlas cerebrais de camundongos4 (por exemplo, cérebro de camundongo de Paxinos e Franklin em coordenadas estereotáxicas) e / ou da literatura publicada 5,6. No entanto, uma validação adicional é necessária devido a variações no equipamento estereotáxico e na idade/populações de camundongos usados por diferentes pesquisadores.
A estrutura é a base da função. Os circuitos neurais formam a base para muitas funções cerebrais, como atividades cognitivas, emoções, memória, funções sensoriais e motoras1. Rotular a estrutura e manipular a atividade dos circuitos neurais são vitais para entender a função de um circuito neural específico. Nas últimas décadas, os traçadores neurais evoluíram ao longo de muitas gerações; pesquisas iniciais adotaram aglutinina de gérmen de trigo (WGA) e aglutinina phaseolus vulgaris (PHA) como traçadores anterógrados, e fluoroouro (FG), subunidade B da toxina da cólera (CTB), carbocianina como traçadores retrógrados. No entanto, ao contrário dos marcadores virais, esses traçadores neurais tradicionais não podem integrar genes exógenos ao hospedeiro, nem têm seletividade de tipo de célula. Atualmente, a estratégia viral tornou-se uma proposta importante durante a pesquisa básica em neurociência. Para diferentes fins de pesquisa, várias ferramentas virais podem ser selecionadas 7,8. Existem vírus não transsinápticos, vírus transmultissinápticos (retrógrados e anterógrados) e vírus transmonossinápticos (retrógrados e anterógrados). Cada categoria contém vários tipos com as respectivas características.
O processo de administração e expressão viral é altamente demorado e intensivo em recursos, muitas vezes levando semanas ou até mais. Dentre os vários vetores virais, o vírus adeno-associado tem sido identificado como um meio promissor para a entrega de genes, proporcionando uma ampla janela que varia de 3 a 8 semanas pós-injeção para o procedimento experimental 7,8. À medida que a VAA evolui, a análise pode ser realizada 2-3 semanas após a administração 9,10. Outros traçadores de circuitos neurais, como o vírus da pseudo-raiva (PRV) e o vírus da raiva (RV), também requerem um período de rastreamento de pelo menos 2-7 dias 11,12,13,14,15. Assim, uma verificação preliminar do local da injeção antes de observar os sinais de fluorescência é eficaz em termos de tempo e custo.
Para facilitar uma verificação simples e rápida das injeções estereotáxicas, neste estudo, um corante é administrado antes dos vetores virais, e a criossecção permite que os pesquisadores observem o local da injeção e o rastreiem dentro de 30 minutos após a injeção.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;L, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>65458-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-200-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3%H2O2 solution</td>
			<td>Lircon Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Shengyou Biotech</td>
			<td>20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anerdian</td>
			<td>Likang High-tech</td>
			<td>31001002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti roll plate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047742497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bend toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellsens dimension software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-Fluoromount-G</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Longxiang</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brushes</td>
			<td>HWAHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>y00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps straight with tooth</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J31010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion needle 0.7 mm</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine hydrochloride injection</td>
			<td>Harvest Pharmaceutical Company</td>
			<td>71230803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male C57/BL mice</td>
			<td>The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research&#8211;BK Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice coronal brain slice mold</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-02-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Cisen Pharmaceutical Company</td>
			<td>G23HDM9M4S5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piette 2-200 &#956;L</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>4642080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaving blades</td>
			<td>BFYING</td>
			<td>91560618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Citotest Scientific</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Holder</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>Aibei Biotechnology</td>
			<td>M2910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preliminary validation of stereotaxic injection coordinates via cryosectioning

A injeção estereotáxica de uma região específica do cérebro constitui uma técnica experimental fundamental na neurociência básica. Os pesquisadores geralmente baseiam sua escolha de parâmetros de injeção estereotáxica em atlas cerebrais de camundongos ou materiais publicados que empregaram várias populações/idades de camundongos e diferentes equipamentos estereotáxicos, necessitando de validação adicional dos parâmetros de coordenadas estereotáxicas. A eficácia das manipulações de imagens de cálcio, quimiogenéticas e optogenéticas depende da expressão precisa de genes repórteres dentro da região de interesse, muitas vezes exigindo várias semanas de esforço. Assim, é uma tarefa demorada se as coordenadas da região alvo do cérebro não forem verificadas com antecedência. Usando um corante apropriado em vez de um vírus e implementando a criossecção, os pesquisadores podem observar o local da injeção imediatamente após a administração do corante. Isso facilita ajustes oportunos para coordenar os parâmetros nos casos em que existem discrepâncias entre o local real da injeção e a posição teórica. Tais ajustes aumentam significativamente a precisão da expressão viral dentro da região-alvo em experimentos subsequentes.

Este estudo identificou com sucesso o local da injeção em 30 minutos usando o método demonstrado. Inicialmente, uma solução de carregamento de amostra SDS-PAGE contendo azul de bromofenol foi injetada no LDTgV nos camundongos C57 / BL. A Figura 1A mostra uma representação esquemática da injeção da solução de corante. A distribuição do corante azul no LDTgV é ilustrada na Figura 1B.
O azul de bromofenol também foi injet...

Autor em destaque: Acelerando a pesquisa de comprometimento cognitivo em camundongos por meio de injeção estereotáxica e corantes econômicos

O presente protocolo descreve uma estratégia prática para agilizar a etapa de verificação das coordenadas de injeção estereotáxica antes de realizar o rastreamento viral usando corantes e seções congeladas.

Validação preliminar de coordenadas de injeção estereotáxica via crioseccionamento

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

Nossa pesquisa se concentra principalmente em investigar o mecanismo dos circuitos neurais subjacentes ao comprometimento cognitivo em camundongos. E frequentemente empregamos técnicas estereotáxicas cerebrais nesses estudos. Nosso objetivo é otimizar e acelerar o processo de verificação de locais de injeção estereotáxica usando corantes, garantindo que se torne um procedimento simples e rápido.Várias estratégias tornaram-se cruciais na pesquisa em neurociência por meio da injeção estereotáxica de vírus. Isso é seguido pela observação de marcadores fluorescentes na fatia de tecido para confirmar os locais de injeção, um processo que leva várias semanas para ser concluído. Nosso protocolo oferece vantagens sobre outras técnicas, economizando pelo menos três dias de tempo de desidratação e usando um corante econômico para identificação mais rápida dos locais de injeção.Pode economizar semanas em comparação com nenhuma verificação preliminar.

preliminary-validation-stereotaxic-injection-coordinates-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

927 visualizações.  Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. Nossa pesquisa se concentra principalmente em investigar o mecanismo dos circuitos neurais subjacentes ao comprometimento cognitivo em camundongos. E frequentemente empregamos técnicas estereotáxicas cerebrais nesses estudos. Nosso objetivo é otimizar e acelerar o processo de verificação de locais de injeção estereotáxica usando corantes, garantindo que se torne um procedimento simples e rápido.Várias estratégias tornaram-se cruciais na pesquisa em neurociência por meio da ...

Vídeo: Autor em destaque: Acelerando a pesquisa de comprometimento cognitivo em camundongos por meio de injeção estereotáxica e corantes econômicos

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Neurociência

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Building An Open-source Robotic Stereotaxic Instrument

This protocol includes the designs and software necessary to upgrade an existing stereotaxic instrument to a robotic (CNC) stereotaxic instrument for around $1,000 (excluding a drill), using industry standard stepper motors and CNC controlling software. Each axis has variable speed control and may be operated simultaneously or independently. The robot&#39;s flexibility and open coding system (g-code) make it capable of performing custom tasks that are not supported by commercial systems. Its applications include, but are not limited to, drilling holes, sharp edge craniotomies, skull thinning, and lowering electrodes or cannula. In order to expedite the writing of g-coding for simple surgeries, we have developed custom scripts that allow individuals to design a surgery with no knowledge of programming. However, for users to get the most out of the motorized stereotax, it would be beneficial to be knowledgeable in mathematical programming and G-Coding (simple programming for CNC machining).
The recommended drill speed is greater than 40,000 rpm. The stepper motor resolution is 1.8&#176;/Step, geared to 0.346&#176;/Step. A standard stereotax has a resolution of 2.88 &#956;m/step. The maximum recommended cutting speed is 500 &#956;m/sec. The maximum recommended jogging speed is 3,500 &#956;m/sec. The maximum recommended drill bit size is HP 2.

This protocol includes the designs and software necessary to upgrade an existing stereotaxic instrument to a robotic (computer numeric controlled; CNC) stereotaxic instrument for around $1,000 (excluding a drill).

Construir um Robotic estereotáxica Instrumento Open-source

This protocol includes the designs and software necessary to upgrade an existing stereotaxic instrument to a robotic (CNC) stereotaxic instrument for ...

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

The CRISPR/Cas9 system offers the potential to make targeted genome editing accessible and affordable to the scientific community. This protocol is intended to demonstrate how to create viruses that will knockout a gene of interest using the CRISPR/Cas9 system, and then inject them stereotaxically into the adult mouse brain.

Concepção, embalagem, entrega e de alto título CRISPR retro e lentivírus via estereotáxica Injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In neuroscience, as well as a plethora of other scientific fields, these techniques are used. Immunohistochemistry can be done on slide mounted tissue or free-floating sections. Preparing slide-mounted samples is a time intensive process. The following protocol for a technique, called the Megabrain, reduced the time taken to cryosection and mount brain tissue by up to 90% by combining multiple brains into a single frozen block. Furthermore, this technique reduced variability seen between staining rounds, in a large histochemical study. The current technique has been optimized for using rodent brain tissue in downstream immunohistochemical analyses; however, it can be applied to different scientific fields that use cryosectioning.

Here, we present a protocol to freeze and section brain tissue from multiple animals as a timesaving alternative to processing single brains. This reduces staining variability during immunohistochemistry and reduces time cryosectioning and imaging.

Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. Previously published protocols recommend using straight needles that should be lowered to a maximum of 1-2 mm from the dural surface. The sudden drop in resistance once the dural membrane has been punctured makes it difficult to maintain the needle in a steady position. Our method, instead, employs a needle bent at the tip that can be stabilized against the occipital bone of the skull, thus preventing the syringe from penetrating into the tissue after perforation of the dural membrane. The procedure is straightforward, reproducible, and does not cause long-lasting discomfort in the operated animals. We describe the intracisternal injection strategy in the context of genetic fate mapping of vascular leptomeningeal cells. The same technique can, furthermore, be utilized to address a wide range of research questions, such as probing the role of leptomeninges in neurodevelopment and the spreading of bacterial meningitis, through genetic ablation of genes putatively implicated in these phenomena. Additionally, the procedure can be combined with an automatized infusion system for a constant delivery and used for tracking cerebrospinal fluid movement via injection of fluorescently labelled molecules.

We describe an intracisternal injection that employs a needle bent at the tip that can be stabilized to the skull, thus eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. The approach can be used for genetic fate mapping and manipulations of leptomeningeal cells and for tracking cerebrospinal fluid movement.

Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

Injeção viral esteretaxica e implantação de lente de índice de gradiente para imagem de cálcio no cérebro profundo em vivo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. This standard approach can be challenging for targets in the caudal brainstem and upper cervical cord due to specific anatomical challenges as these sites are remote from skull landmarks, leading to imprecision. Here we outline an alternative stereotaxic approach via the cisterna magna that has been used to target discrete regions of interest in the caudal brainstem and upper cervical cord. The cisterna magna extends from the occipital bone to the atlas (i.e., the second vertebral bone), is filled with cerebrospinal fluid, and is covered by dura mater. This approach provides a reproducible route of access to select central nervous system (CNS) structures that are otherwise hard to reach due to anatomical barriers. Furthermore, it allows for direct visualization of brainstem landmarks in close proximity to the target sites, increasing accuracy when delivering small injection volumes to restricted regions of interest in the caudal brainstem and upper cervical cord. Finally, this approach provides an opportunity to avoid the cerebellum, which can be important for motor and sensorimotor studies.

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice commonly involves access through the skull bones and is guided by skull landmarks. Here we outline an alternative stereotaxic approach to target the caudal brainstem and upper cervical spinal cord via the cisterna magna that relies on direct visualization of brainstem landmarks.

Abordagem Cirúrgica Estereotaxic para Microinpor o Tronco Cerebral Caudal e Medula Espinhal Cervical Superior através da Cisterna Magna em Camundongos

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. ...

Crioseccionamento do gânglio da raiz dorsal do rato

A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

High-quality mouse dorsal root ganglion (DRG) cryostat sections are crucial for proper immunochemistry staining and RNAscope studies in the research of inflammatory and neuropathic pain, itch, as well as other peripheral neurological conditions. However, it remains a challenge to consistently obtain high-quality, intact, and flat cryostat sections onto glass slides because of the tiny sample size of the DRG tissue. So far, there is no article describing an optimal protocol for DRG cryosectioning. This protocol presents a step-by-step method to resolve the frequently encountered difficulties associated with DRG cryosectioning. The presented article explains how to remove the surrounding liquid from the DRG tissue samples, place the DRG sections on the slide facing the same orientation, and flatten the sections on the glass slide without curving up. Although this protocol has been developed for cryosectioning the DRG samples, it can be applied for the cryosectioning of many other tissues with a small sample size.

Autor em destaque: um procedimento para crioseccionamento do gânglio da raiz dorsal do camundongo  

Presented here is the development for consistently acquiring high-quality dorsal root ganglion cryostat sections.

Um procedimento para criossecção do gânglio da raiz dorsal de camundongos

High-quality mouse dorsal root ganglion (DRG) cryostat sections are crucial for proper immunochemistry staining and RNAscope studies in the research of ...